Молекулярно-генетични методи за диагностика на наследствени заболявания

Методите на ДНК технологията се използват за определяне на локализацията на мутантен ген в определена хромозома, отговорна за произхода на определени форми на наследствена патология. Тъй като генът е участък от ДНК, а генната мутация е увреждане на първичната структура на ДНК (мутация се разбира като всички промени в ДНК последователността, независимо от тяхната локализация и влияние върху жизнеспособността на индивида), тогава чрез сондиране на препарати от метафазни хромозоми на пациент с наследствено заболяване е възможно да се установи локализацията на патологичния ген. Молекулярно-генетичните методи създават възможности за диагностициране на заболявания на ниво променена структура на ДНК, те ни позволяват да определим локализацията на наследствени нарушения. Молекулярно-генетичните методи могат да идентифицират мутации, свързани със заместването дори на една-единствена база.

Най-важният етап от идентификацията на гена е неговото изолиране. ДНК може да бъде изолирана от всякакъв вид тъкан и клетки, съдържащи ядра. Етапите на изолиране на ДНК включват: бърз лизис на клетките, отстраняване на фрагменти от клетъчни органели и мембрани чрез центрофугиране, ензимно разрушаване на протеините и тяхното извличане от разтвор с помощта на фенол и хлороформ, концентриране на ДНК молекули чрез утаяване в етанол.

В генетичните лаборатории ДНК най-често се изолира от кръвни левкоцити, за което от пациента се взема 5-20 мл венозна кръв в стерилна епруветка с разтвор на антикоагулант (хепарин). След това левкоцитите се отделят и обработват съгласно горните стъпки.

Следващият етап от подготовката на материала за изследване е „нарязване“ на ДНК на фрагменти в области със строго специфична базова последователност, което се извършва с помощта на бактериални ензими - рестрикционни ендонуклеази (рестрикционни ензими). Рестрикционните ензими разпознават специфични последователности от 4-6, по-рядко 8-12 нуклеотида в двуверижна ДНК молекула и я разделят на фрагменти на местата на тези последователности, наречени рестрикционни сайтове. Броят на получените рестрикционни фрагменти на ДНК се определя от честотата на поява на рестрикционните сайтове, а размерът на фрагментите се определя от естеството на разпределението на тези сайтове по дължината на оригиналната ДНК молекула. Колкото по-често са разположени рестрикционните сайтове, толкова по-къси са ДНК фрагментите след рестрикцията. В момента са известни повече от 500 различни вида рестрикционни ензими с бактериален произход и всеки от тези ензими разпознава своята специфична нуклеотидна последователност. В бъдеще рестрикционните сайтове могат да се използват като генетични маркери на ДНК. ДНК фрагментите, образувани в резултат на рестрикцията, могат да бъдат подредени по дължина чрез електрофореза в агарозен или полиакриламиден гел и по този начин да се определи тяхното молекулно тегло. Обикновено ДНК в гел се идентифицира чрез специфично оцветяване (обикновено с етидиев бромид) и наблюдение на гела в пропускаща ултравиолетова светлина. Местата на локализация на ДНК са оцветени в червено. При хората обаче, когато ДНК се обработва от няколко рестрикционни ензима, се образуват толкова много фрагменти с различна дължина, че те не могат да бъдат разделени чрез електрофореза, т.е. не е възможно визуално да се идентифицират отделни ДНК фрагменти при електрофорезата (получава се равномерно оцветяване по цялата дължина на гела). Следователно, за да се идентифицират желаните ДНК фрагменти в такъв гел, се използва методът на хибридизация с маркирани ДНК сонди.

Всеки едноверижен сегмент от ДНК или РНК е способен да се свързва (хибридизира) с комплементарна верига, като гуанинът винаги се свързва с цитозин, а аденинът с тимин. Така се образува двуверижна молекула. Ако едноверижно копие на клониран ген се маркира с радиоактивен маркер, се получава сонда. Сондата е способна да намери комплементарен сегмент от ДНК, който след това лесно се идентифицира с помощта на авторадиография. Радиоактивна сонда, добавена към препарат от разтегнати хромозоми, позволява генът да бъде локализиран върху специфична хромозома: с помощта на ДНК сонда могат да бъдат идентифицирани специфични области по време на Southern blotting. Хибридизацията се случва, ако тестваният ДНК участък съдържа нормален ген. В случай че е налице анормална нуклеотидна последователност, т.е. съответните хромозомни структури съдържат мутантен ген, хибридизацията няма да се случи, което позволява да се определи локализацията на патологичния ген.

За получаване на ДНК сонди се използва методът на клониране на гени. Същността на метода е, че ДНК фрагмент, съответстващ на ген или секция от ген, се вмъква в клонираща частица, обикновено бактериален плазмид (пръстеновидна екстрахромозомна ДНК, присъстваща в бактериалните клетки и носеща гени за антибиотична резистентност), след което бактериите с плазмида с вмъкнатия човешки ген се размножават. Благодарение на процесите на синтез в плазмида могат да се получат милиарди копия на човешкия ген или негова секция.

Получените ДНК копия, маркирани с радиоактивен маркер или флуорохроми, след това се използват като сонди за търсене на комплементарни последователности сред изследвания пул от ДНК молекули.

В момента съществуват много различни видове методи, използващи ДНК сонди за диагностициране на генни мутации.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]