Диагностика на митохондриални заболявания

Оценка на характера на наследяването и проявата на клинични признаци на митохондриални заболявания

Тъй като миохондриалните заболявания в някои случаи могат да бъдат причинени от увреждане на ядрения геном, предаването на заболяването ще съответства на Менделовите закони за наследяване. В случаите, когато развитието на заболяването е причинено от мутации в митохондриалната ДНК, наследяването ще съответства на митохондриалния тип, т.е. ще се предава по майчина линия. Накрая, когато патологията се развива с едновременно увреждане на гените на ядрения и митохондриалния геном, наследяването ще бъде сложно и определено от различни фактори. В тази връзка, при генеалогичния анализ по формален признак (характерът на наследяване според родословието), е възможно да се посочат най-различни видове наследяване: автозомно доминантно, автозомно рецесивно, Х-свързано, митохондриално.

Развитието на миохондриални заболявания като нарушение на метаболизма на пирувиновата киселина или бета-окисление на мастни киселини, цикъл на Кребс, е свързано с мутации в гените на ядрения геном. Тези патологии се характеризират с автозомно-рецесивно унаследяване, когато родителите са носители на мутации (хетерозиготи), а детето е носител и на двете наследствени мутации, получени от бащата и майката (хомозигота). Родителите обикновено са външно здрави и подобно заболяване или негови микропризнаци трябва да се търсят при братята и сестрите на болното дете (пробанд сибс) и при роднини както от майчина, така и от бащина страна (братовчеди).

В случай на рецесивен, Х-свързан тип наследяване (напр. неонатална глутарова ацидурия тип II или дефицит на E1 субединицата на пирувитния комплекс, болест на Менкес и др.), момчетата са по-често засегнати, а майките са носители на мутации и ги предават на синовете си. Майчиното наследяване се различава от Х-свързаното наследяване по това, че и двата пола са засегнати. В тези случаи, при анализа на родословието, е необходимо да се анализира честотата на заболяването при мъжете, тъй като то няма да се прояви при жените. Родословието не показва предаване на заболяването по линия баща-син, тъй като бащата може да предаде само Y хромозомата на сина си.

Когато дадено заболяване се развие поради увреждане на митохондриалния геном (например редица заболявания на дихателната верига, оптична невропатия на Лебер, MELAS, MERF, NARP синдроми и др.), се проследява майчиното наследство, тъй като детето наследява митохондриите от майката и тя може да ги предаде както на момчета, така и на момичета. По този начин и двата пола са засегнати еднакво. В тази връзка предаването на заболяването по майчина линия трябва да се проследи в родословието.

При анализ на родословно дърво и търсене на симптоми на митохондриални заболявания при роднини, трябва да се помни, че тежестта на заболяването (изразителност на признака) може да варира в широки граници, което може да се дължи на различния брой увредени митохондрии, характера на тяхното увреждане, различното разпределение на мутациите в клетките и др. По този начин не винаги е възможно да се открият очевидни признаци на заболявания. В някои случаи се откриват или отделни, изтрити симптоми, или признаци, които могат да бъдат открити по време на целенасоченото им търсене.

Развитието на митохондриалната патология може да бъде свързано с увреждане на големи области от митохондриите, така наречените микроделеции (например синдром на Kearns-Sayre, синдром на Pearson, някои форми на захарен диабет с глухота, прогресивна външна офталмоплегия и др.). В тези случаи характерните симптоми често не се откриват при роднини, тъй като развитието на заболяванията е свързано с появата на нови мутации, възникнали в зиготата веднага след оплождането на яйцеклетката ( de novo мутация). Заболяването е спорадично. Често, наред с тези заболявания, редица състояния, свързани с множествени мутации на митохондриална ДНК, се унаследяват по автозомно доминантен начин: например, някои форми на енцефаломиопатия, миопатия с увреждане на очите, въпреки наличието на мутации в mtDNA (множествени делеции), имат автозомно доминантен тип наследяване.

Въпреки това, за разлика от Менделовото наследяване, автозомно-доминантният тип наследяване при митохондриалната патология се характеризира с голям брой засегнати индивиди в следващите поколения.

Накрая, някои митохондриални заболявания, често свързани с изчерпване на мтДНК в митохондриите или с тяхната липса в клетките, могат да се унаследяват по автозомно-рецесивен начин. Те включват вродени форми на миопатия, кардиомиопатия, невродистресен синдром, лактатна ацидоза, увреждане на черния дроб и др.

Изучаването на естеството на наследственото предаване на заболяването е важно за медицинската и генетичната прогноза и изисква задълбочен анализ на клиничните признаци с познаване на механизмите на формиране на митохондриалната патология и видовете нейното унаследяване.

Проявата на клиничните прояви варира значително от първите дни от живота до зряла възраст. При анализа на този показател е необходимо да се вземат предвид нозологичните форми, тъй като всяка от тях има определена възраст на дебют.

Метаболитните нарушения, наблюдавани при митохондриални заболявания, са прогресивни в по-голямата част от случаите. Първоначалните симптоми често са леки, след което прогресират и могат да доведат до значителни инвалидизиращи разстройства. Редки форми на патология, като доброкачествена инфантилна миопатия и някои форми на оптична невропатия на Лебер, могат да бъдат доброкачествени и подлежащи на регресия.

По време на лабораторните изследвания се обръща внимание на характерните признаци на митохондриалните заболявания:

• наличие на ацидоза;
• повишени нива на лактат и пируват в кръвта, повишаване на индекса лактат/пируват с повече от 15, особено нарастващо при натоварване с глюкоза или физическо натоварване;
• хиперкетонемия;
• хипогликемия;
• хиперамонемия;
• повишени концентрации на ацетоацетат и 3-хидроксибутират;
• повишено съотношение на 3-хидроксимаслена киселина/ацетооцетна киселина в кръвта;
• повишени нива на аминокиселини в кръвта и урината (аланин, глутамин, глутаминова киселина, валин, левцин, изолевцин);
• повишени нива на мастни киселини в кръвта;
• хиперекскреция на органични киселини в урината;
• намалени нива на карнитин в кръвта;
• повишаване на съдържанието на миоглобин в биологичните течности;
• намалена активност на митохондриалните ензими в миоцитите и фибробластите.

Диагностичната стойност на тези показатели е по-висока при хранително натоварване, отколкото на гладно. На практика диагностичният тест се е доказал добре: определяне на лактат в кръвта на фона на глюкозно натоварване, което позволява по-отчетливо откриване на недостатъчността на дихателната верига при допълнително глюкозно натоварване.

За лабораторна диагностика на митохондриалната дисфункция и нейните специфични нозологични форми, конвенционалните, рутинни биохимични методи на изследване не са достатъчни; необходимо е провеждането на специални тестове. Особено удобно е да се анализира активността на ензимите в биопсии на скелетните мускули, отколкото в други тъкани. Възможно е да се определи активността на ензимите на дихателната верига, особено цитрат синтетазата, сукцинат дехидрогеназата и цитохром С оксидазата.

Данни от морфологични и молекулярно-генетични изследвания

Морфологичните изследвания са от особено значение при диагностицирането на митохондриална патология. Поради голямата им информативна стойност често се налага биопсия на мускулна тъкан и хистохимично изследване на получените биопсии. Важна информация може да се получи чрез едновременно изследване на материала с помощта на светлинна и електронна микроскопия.

Един от важните маркери на митохондриалните заболявания е феноменът на „разкъсани“ червени влакна [феноменът RRF (ragged red fibres)], установен през 1963 г. Той е свързан с образуването на генетично променени анормални митохондрии по ръба на мускулното влакно, поради пролиферация и фокално натрупване. Този феномен се открива чрез светлинна микроскопия с помощта на специално оцветяване по Гомори, но през последните години за тази цел се използват различни митохондриални маркери и различни имунологични методи.

Други морфологични признаци на митохондриална патология включват:

• рязко увеличение на размера на митохондриите;
• натрупване на гликоген, липиди и калциеви конгломерати в субсарколемата;
• намалена активност на митохондриалните ензими;
• нарушено разпределение на гранулите от активността на ензимите сукцинат дехидрогеназа (SDH), NADH оксидоредуктаза, цитохром С оксидаза и др.

При пациенти с митохондриални заболявания, светлинната микроскопия на мускулната тъкан може да разкрие неспецифични морфологични признаци: локална некроза на мускулните влакна, натрупване на саркоплазмени маси, наличие на лизис на субсарколемални области на саркоплазмата, базофилия на саркоплазмата, увеличен брой мускулни ядра, активиране на процесите на регенерация и др.

Изследването на ролята на феномена „накъсани“ червени влакна показа неговото значение за диагностицирането на състояния като MELAS, MERRF, синдроми на Kearns-Sayre, хронична прогресивна офталмоплегия и други, свързани с мутации в mtDNA. Този феномен може да се развие и при други заболявания: мускулна дистрофия на Дюшен, дерматомиозит, миотонична дистрофия, прием на лекарства (клофибрат) и други патологични състояния. По този начин, наред с първичните митохондриални заболявания, феноменът RRF може да съпътства вторични митохондриални дисфункции.

В момента хистохимичното и електронно-микроскопското изследване на мускулната тъкан за откриване на признаци на митохондриална недостатъчност е станало широко разпространено. В някои случаи те помагат при поставянето на диагноза, особено при нормална морфологична картина на мускулната тъкан според данните от светлинната микроскопия.

Електронно-микроскопски признаци - откриване на митохондриална пролиферация, нарушаване на тяхната форма и размер, дезорганизация и уголемяване на кристи, натрупване на анормални митохондрии под сарколемата, натрупване на липиди и анормални паракристални (състоящи се предимно от протеини) или осмофилни включвания, локализирани между вътрешната и външната мембрана или в рамките на кристите, сферични клъстери, често разположени в матрикса (състоящи се предимно от триглицериди) и др.

При някои пациенти могат да се открият цитохимични аномалии в левкоцитите.

Комплексът от биохимични и морфологични изследвания се допълва от съвременни методи на молекулярна диагностика (откриване на ядрени или митохондриални мутации), които се извършват в специализирани ДНК диагностични лаборатории. При митохондриални заболявания се откриват различни видове мутации: точкови мутации, делеции, дупликации, количествени ДНК аномалии и др.

При липса на мутации в мтДНК, ако се подозира митохондриална патология, се извършва изследване на ядрена ДНК.

Диагностични критерии

Съществуват 2 групи диагностични критерии за митохондриални заболявания. Основни диагностични критерии (първа група).

• Клинични:
  • установени диагнози: MERRF, MELAS, NARP, MNGIE, синдроми на Пиърсън, невропатия на Лебер, болести на Лий и Алперс;
  • наличието на 2 или комбинация от следните признаци:
    • мултисистемна лезия, патогномонична за заболявания на дихателната верига;
    • прогресиращ ход с епизоди на обостряне или наличие на митохондриални мутации в семейството;
    • изключване на метаболитни и други заболявания чрез провеждане на подходящи изследвания.
• Хистологично - откриване на феномена RRF в повече от 2% от мускулната тъкан.
• Ензимен:
  • цитохром с оксидаза-отрицателни влакна;
  • намалена активност на ензимите от дихателната верига (<20% от нормата в тъканите, <30% в клетките или няколко тъкани).
• Функционално - намаляване на синтеза на АТФ във фибробластите с повече от 3 стандартни отклонения.
• Молекулярно-генетични - патогенетично значими мутации на ядрената или мтДНК.

Допълнителни диагностични критерии (втора група).

• Клинични - неспецифични симптоми, които се появяват при заболявания на дихателната верига (мъртво раждане, намалена двигателна активност на плода, ранна неонатална смърт, двигателни нарушения, нарушения в развитието, нарушен мускулен тонус в неонаталния период).
• Хистологично - малък процент RRF феномен, субсарколемално натрупване на митохондрии или техни аномалии.
• Ензимна - ниска активност на ензимите на дихателния комплекс (20-30% от нормата в тъканите, 30-40% в клетките или клетъчните линии).
• Функционално - намаляване на синтеза на АТФ във фибробластите с 2-3 стандартни отклонения или липса на растеж на фибробласти в среда с галактоза.
• Молекулярна генетика - откриване на мутации в ядрената или мтДНК с предполагаема патогенетична връзка.
• Метаболитен - откриване на един или повече метаболити, показващи нарушение в клетъчната биоенергетика.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]