Роля на ензимите и цитокините в патогенезата на остеоартрита

През последните години голямо внимание на изследователите е насочено към идентифициране на протеази, отговорни за разграждането на извънклетъчната мембрана на ставния хрущял при остеоартроза. Според съвременните схващания, матриксните металопротеинази (ММП) играят важна роля в патогенезата на остеоартрозата. При пациенти с остеоартроза се открива повишено ниво на три ММП - колагенази, стромелизини и желатинази. Колагеназата е отговорна за разграждането на естествения колаген, стромелизинът - на колаген тип IV, протеогликани и ламинин, желатиназата - за разграждането на желатин, колагени IV, Vh XI типове, еластин. Освен това се предполага наличието на друг ензим - агреканаза, който има свойствата на ММП и е отговорен за протеолизата на хрущялните протеогликанови агрегати.

В човешкия ставен хрущял са идентифицирани три вида колагенази, чиито нива са значително повишени при пациенти с остеоартрит: колагеназа-1 (MMP-1), колагеназа-2 (MMP-8) и колагеназа-3 (MMP-13). Съвместното съществуване на три различни вида колагенази в ставния хрущял предполага, че всеки от тях играе своя специфична роля. Всъщност, колагеназите-1 и -2 са локализирани главно в повърхностната и горната междинна зона на ставния хрущял, докато колагеназа-3 се намира в долната междинна зона и в дълбоката зона. Освен това, резултатите от имунохистохимично проучване показват, че с напредването на остеоартрита нивото на колагеназа-3 достига плато и дори намалява, докато нивото на колагеназа-1 постепенно се увеличава. Има доказателства, че при остеоартрит колагеназа-1 участва главно във възпалителния процес в ставния хрущял, докато колагеназа-3 участва в тъканното ремоделиране. Колагеназа-3, експресирана в хрущяла на пациенти с остеоартрит, разгражда колаген тип II по-интензивно от колагеназа-1.

От представителите на втората група металопротеинази, три също са идентифицирани в човешкия стромелизин: стромелизин-1 (MMP-3), стромелизин-2 (MMP-10) и стромелизин-3 (MMP-11). Днес е известно, че само стромелизин-1 участва в патологичния процес при остеоартроза. Стромелизин-2 не се открива в синовиалната мембрана на пациенти с остеоартроза, но се намира в много малки количества в синовиалните фибробласти на пациенти с ревматоиден артрит. Стромелизин-3 се открива също в синовиалната мембрана на пациенти с ревматоиден артрит в близост до фибробласти, особено във фиброзни зони.

В групата на желатиназите в човешката хрущялна тъкан са идентифицирани само две: 92 kD желатиназа (желатиназа B или MMP-9) и 72 kD желатиназа (желатиназа A или MMP-2); при пациенти с остеоартрит се определя повишаване на нивото на 92 kD желатиназа.

Наскоро беше идентифицирана друга група ММП, които са локализирани на повърхността на клетъчните мембрани и се наричат мембранни ММП (ММП-МТ). Тази група включва четири ензима - ММП-МТ1 - ММП-МТ-4. Експресия на ММП-МТ е открита в човешкия ставен хрущял. Въпреки че ММП-МТ-1 има колагеназни свойства, и двата ензима, ММП-МТ-1 и ММП-МТ-2, са способни да активират желатиназа-72 kDa и колагеназа-3. Ролята на тази група ММП в патогенезата на остеоартрита изисква изясняване.

Протеиназите се секретират под формата на зимоген, който се активира от други протеинази или органични живачни съединения. Каталитичната активност на MMP зависи от наличието на цинк в активната зона на ензима.

Биологичната активност на MMP (микромеланхолитична металургична прогестеронна фосфатаза) се контролира от специфични TIMP (тимолептични интерферонни импулсни протеини). Към днешна дата са идентифицирани три вида TIMP, които се намират в човешките ставни тъкани: TIMP-1–TIMP-3. Четвърти тип TIMP е идентифициран и клониран, но той все още не е открит в човешките ставни тъкани. Тези молекули се свързват специфично с активния център на MMP, въпреки че някои от тях са способни да се свързват с активния център на 72 kD прожелатиназа (TIMP-2, -3, -4) и 92 kD прожелатиназа (TIMP-1 и -3). Данните сочат, че при остеоартрит (ОА) има дисбаланс между MMP и TIMP в ставния хрущял, което води до относителен дефицит на инхибитори, вероятно поради частично повишаване на нивото на активни MMP в тъканта. TIMP-1 и -2 се намират в ставния хрущял и се синтезират от хондроцити. При остеоартроза само TIMP тип I се открива в синовиалната мембрана и синовиалната течност. TIMP-3 се намира изключително в ECM (екстремалния матрикс). TIMP-4 споделя почти 50% от аминокиселинната си последователност с TIMP-2 и 38% с TIMP-1. В други целеви клетки, TIMP-4 е отговорен за модулирането на активирането на 72 kD прожелатиназа върху клетъчната повърхност, което показва важна роля като тъканно-специфичен регулатор на ремоделирането на ECM.

Друг механизъм за контролиране на биологичната активност на MMP е тяхното физиологично активиране. Смята се, че ензими от семейството на сериновите и цистеиновите протеази, като съответно AP/плазмин и катепсин B, са физиологични активатори на MMP. Повишени нива на урокиназа (uAP) и плазмин са открити в ставния хрущял на пациенти с остеоартрит.

Въпреки факта, че в ставните тъкани се откриват няколко вида катепсини, катепсин-B се счита за най-вероятния активатор на MMP в хрущяла. Физиологични инхибитори на серинови и цистеинови протеази са открити в човешките ставни тъкани. Активността на AP-1 инхибитора (IAI-1), както и на цистеиновите протеази, е намалена при пациенти с остеоартрит. Подобно на MMP/TIMP, именно дисбалансът между серинови и цистеинови протеази и техните инхибитори може да обясни повишената активност на MMP в ставния хрущял на пациенти с остеоартрит. Освен това, MMP са способни да се активират взаимно. Например, стромелизин-1 активира колагеназа-1, колагеназа-3 и 92 kD желатиназа; колагеназа-3 активира 92 kD желатиназа; MMP-MT активира колагеназа-3, а желатиназа-72 kDa потенцира това активиране; MMP-MT също активира желатиназа 72 kDa. Цитокините могат да бъдат разделени на три групи - деструктивни (възпалителни), регулаторни (включително противовъзпалителни) и анаболни (растежни фактори).

Видове цитокини (според van den Berg WB et al)

Разрушителен	Интерлевкин-1 TNF-α Инхибиторен фактор на левкемия Интерлевкин-17
Регулаторни	Интерлевкин-4 Интерлевкин-10 Интерлевкин-13 Ензимни инхибитори
Анаболен	Инсулиноподобни растежни фактори TGF-β Костни морфогенетични протеини Морфогенетични протеини, получени от хрущял

Деструктивните цитокини, по-специално IL-1, индуцират увеличаване на освобождаването на протеази и инхибират синтеза на протеогликани и колагени от хондроцитите. Регулаторните цитокини, по-специално IL-4 и -10, инхибират производството на IL-1, увеличават производството на антагониста на IL-1 рецептора (IL-1RA) и намаляват нивото на NO синтазата в хондроцитите. По този начин, IL-4 противодейства на IL-1 в три посоки: 1) намалява производството, предотвратявайки неговите ефекти, 2) увеличава производството на основния "поглъщател" IL-1RA и 3) намалява производството на основния вторичен "посредник" NO. Освен това, IL-4 намалява ензимното разграждане на тъканите. In vivo, оптималният терапевтичен ефект се постига с комбинация от IL-4 и IL-10. Анаболните фактори като TGF-β и IGF-1 всъщност не пречат на производството или действието на IL-1, но проявяват обратна активност, например стимулират синтеза на протеогликани и колаген, потискат активността на протеазите, а TGF-β също инхибира освобождаването на ензими и стимулира техните инхибитори.

Провъзпалителните цитокини са отговорни за повишения синтез и експресия на MMP в ставните тъкани. Те се синтезират в синовиалната мембрана и след това дифундират в ставния хрущял през синовиалната течност. Провъзпалителните цитокини активират хондроцитите, които от своя страна също са способни да произвеждат провъзпалителни цитокини. В ставите, засегнати от остеоартроза, ролята на ефектор на възпалението се играе главно от клетки на синовиалната мембрана. Именно синовоцитите от макрофагов тип секретират протеази и възпалителни медиатори. Сред тях IL-f, TNF-a, IL-6, левкемичен инхибиторен фактор (LIF) и IL-17 са най-„ангажирани“ в патогенезата на остеоартрозата.

Биологично активни вещества, които стимулират разграждането на ставния хрущял при остеоартрит

• Интерлевкин-1
• Интерлевкин-3
• Интерлевкин-4
• TNF-α
• Колониостимулиращи фактори: макрофаги (моноцити) и гранулоцити-макрофаги
• Вещество П
• СТР _{. 2}
• Плазминогенни активатори (тъканни и урокиназни видове) и плазмин
• Металопротеинази (колагенази, еластази, стромелизини)
• Катепсини А и В
• Трилсин
• Бактериални липополизахариди
• Фосфолипаза Ag

Литературните данни показват, че IL-1 и евентуално TNF-α са основните медиатори на разрушаването на ставната тъкан при остеоартроза. Все още обаче не е известно дали те действат независимо един от друг или между тях съществува функционална йерархия. Животински модели на остеоартроза показват, че блокадата на IL-1 ефективно предотвратява разрушаването на ставния хрущял, докато блокадата на TNF-α води само до намаляване на възпалението в ставните тъкани. Повишени концентрации на двата цитокина са открити в синовиалната мембрана, синовиалната течност и хрущяла на пациентите. В хондроцитите те са способни да увеличат синтеза не само на протеази (главно MMP и AP), но и на второстепенни колагени, като типове I и III, и да намалят синтеза на колагени типове II и IX и протеогликани. Тези цитокини също стимулират реактивни кислородни видове и възпалителни медиатори като PGE2 _. Резултатът от такива макромолекулни промени в ставния хрущял при остеоартрит е неефективността на репаративните процеси, което води до по-нататъшно разграждане на хрущяла.

Гореспоменатите провъзпалителни цитокини модулират процесите на потискане/активиране на MMP при остеоартроза. Например, дисбалансът между нивата на TIMP-1 и MMP в хрущяла при остеоартроза може да бъде медииран от IL-1, тъй като in vitro проучване показа, че повишаването на концентрациите на IL-1 бета води до намаляване на концентрациите на TIMP-1 и увеличаване на синтеза на MMP от хондроцитите. Синтезът на AP също се модулира от IL-1 бета. In vitro стимулацията на хондроцитите на ставния хрущял с IL-1 причинява дозозависимо увеличение на синтеза на AP и рязко намаляване на синтеза на iAP-1. Способността на IL-1 да намалява синтеза на iAP-1 и да стимулира синтеза на AP е мощен механизъм за генериране на плазмин и активиране на MMP. Освен това, плазминът е не само ензим, който активира други ензими, но и участва в процеса на разграждане на хрущяла чрез директна протеолиза.

IL-ip се синтезира като неактивен прекурсор с маса 31 kD (pre-IL-ip) и след това, след разцепване на сигналния пептид, се превръща в активен цитокин с маса 17,5 kD. В ставните тъкани, включително синовиалната мембрана, синовиалната течност и ставния хрущял, IL-ip се намира в активна форма, а in vivo проучванията са показали способността на синовиалната мембрана при остеоартроза да секретира този цитокин. Някои серинови протеази са способни да превърнат pre-IL-ip в неговата биоактивна форма. При бозайниците такива свойства са открити само в една протеаза, която принадлежи към семейството на цистеин аспартат-специфичните ензими и се нарича IL-1β-конвертиращ ензим (ICF, или каспаза-1). Този ензим е способен специфично да превърне pre-IL-ip в биологично активен "зрял" IL-ip с маса 17,5 kD. ICF е 45 kD проензим (p45), който е локализиран в клетъчната мембрана. След протеолитично разцепване на проензима p45 се образуват две субединици, известни като p10 и p20, които се характеризират с ензимна активност.

TNF-α се синтезира и като мембранно-свързан прекурсор с маса 26 kDa; чрез протеолитично разцепване се освобождава от клетката като активна разтворима форма с маса 17 kDa. Протеолитичното разцепване се осъществява от TNF-α-конвертиращ ензим (TNF-AC), който принадлежи към семейството на адамализините. AR Amin et al. (1997) установяват повишена експресия на TNF-AC mRNA в ставния хрущял на пациенти с остеоартрит.

Биологичната активация на хондроцитите и синовицитите от IL-1 и TNF-α се медиира чрез свързване със специфични рецептори на клетъчната повърхност - IL-R и TNF-R. За всеки цитокин са идентифицирани два вида рецептори - IL-IP типове I и II и TNF-R типове I (p55) и II (p75). IL-1PI и p55 са отговорни за предаването на сигнала в клетките на ставната тъкан. IL-1R тип I има малко по-висок афинитет към IL-1β, отколкото към IL-1α; IL-1R тип II, напротив, има по-висок афинитет към IL-1α, отколкото към IL-ip. Остава неясно дали IL-IP тип II може да медиира IL-1 сигналите или служи само за конкурентно инхибиране на асоциацията на IL-1 с IL-1R тип I. Хондроитидите и синовиалните фибробласти на пациенти с остеоартроза съдържат големи количества IL-1PI и p55, което от своя страна обяснява високата чувствителност на тези клетки към стимулация от съответните цитокини. Този процес води както до повишена секреция на протеолитични ензими, така и до разрушаване на ставния хрущял.

Участието на IL-6 в патологичния процес при остеоартрит не може да бъде изключено. Това предположение се основава на следните наблюдения:

• IL-6 увеличава броя на възпалителните клетки в синовиалната мембрана,
• IL-6 стимулира пролиферацията на хондроцити,
• IL-6 усилва ефектите на IL-1, като увеличава синтеза на MMP и инхибира синтеза на протеогликани.

Въпреки това, IL-6 е способен да индуцира производството на TIMP, но не повлиява производството на MMP, така че се смята, че този цитокин участва в процеса на инхибиране на протеолитичното разграждане на ставния хрущял, което се осъществява чрез механизъм на обратна връзка.

Друг член на семейството на IL-6 е LIF, цитокин, произвеждан от хондроцити, получени от пациенти с остеоартроза, в отговор на стимулация от провъзпалителните цитокини IL-1p и TNF-a. LIF стимулира резорбцията на хрущялни протеогликани, както и синтеза на MMP и производството на NO. Ролята на този цитокин при остеоартроза не е напълно изяснена.

IL-17 е 20-30 kD хомодимер с IL-1-подобен ефект, но много по-слабо изразен. IL-17 стимулира синтеза и освобождаването на редица провъзпалителни цитокини, включително IL-1β, TNF-α, IL-6 и MMP в целевите клетки, като човешки макрофаги. Освен това, IL-17 стимулира производството на NO от хондроцитите. Подобно на LIF, ролята на IL-17 в патогенезата на остеоартрита е слабо проучена.

Неорганичният свободен радикал NO играе важна роля в разграждането на ставния хрущял при остеоартрит. Хондроцитите, изолирани от пациенти с остеоартрит, произвеждат по-високи количества NO както спонтанно, така и след стимулация с провъзпалителни цитокини в сравнение с нормалните клетки. Високо съдържание на NO е установено в синовиалната течност и серума на пациенти с остеоартрит - това е резултат от повишена експресия и синтез на индуцирана NO синтаза (hNOC), ензимът, отговорен за производството на NO. Наскоро беше клонирана ДНК на хондроцитно-специфичен hNOC и беше определена аминокиселинната последователност на ензима. Аминокиселинната последователност показва 50% идентичност и 70% сходство с hNOC, специфичен за ендотела и нервната тъкан.

NO инхибира синтеза на макромолекули на извънклетъчната мембрана (ECM) на ставния хрущял и стимулира синтеза на MMP. Освен това, увеличаването на производството на NO е съпроводено с намаляване на синтеза на IL-IP антагониста (IL-1RA) от хондроцитите. По този начин, повишаването на нивото на IL-1 и намаляването на IL-1RA води до хиперстимулация на NO в хондроцитите, което от своя страна води до повишена деградация на хрущялната матрица. Има съобщения за терапевтичния ефект in vivo на селективен hNOC инхибитор върху прогресията на експериментална остеоартроза.

Естествените цитокинови инхибитори са способни директно да предотвратят свързването на цитокините с рецепторите на клетъчната мембрана, намалявайки тяхната провъзпалителна активност. Естествените цитокинови инхибитори могат да бъдат разделени на три класа въз основа на техния начин на действие.

Първият клас инхибитори включва рецепторни антагонисти, които предотвратяват свързването на лиганда с неговия рецептор, като се конкурират за мястото на свързване. Досега такъв инхибитор е открит само за IL-1 - това е гореспоменатият конкурентен инхибитор на IL-1/ILIP системата IL-1 PA. IL-1 PA блокира много ефекти, които се наблюдават в ставните тъкани при остеоартрит, включително синтеза на простагландини от синовиалните клетки, производството на колагеназа от хондроцитите и разграждането на костната тъкан на ставния хрущял.

IL-1RA се среща в различни форми - една разтворима (rIL-1RA) и две междуклетъчни (μIL-lPAI и μIL-1RAP). Афинитетът на разтворимата форма на IL-1RA е 5 пъти по-висок от този на междуклетъчните форми. Въпреки интензивните научни изследвания, функцията на последната остава неизвестна. In vitro експерименти показват, че инхибирането на активността на IL-1β изисква концентрация на IL-1RA 10-100 пъти по-висока от нормалната, докато in vivo условията изискват хилядократно увеличение на концентрацията на IL-1RA. Този факт може частично да обясни относителния дефицит на IL-1RA и излишъка на IL-1 в синовиума на пациенти с остеоартроза.

Вторият клас естествени цитокинови инхибитори са разтворимите цитокинови рецептори. Примери за такива инхибитори при хора, които са свързани с патогенезата на остеоартрита, са rIL-1R и pp55. Разтворимите цитокинови рецептори са съкратени форми на нормалните рецептори; когато се свързват с цитокини, те предотвратяват свързването им с мембранно-асоциирани рецептори на целевите клетки, действайки чрез механизма на конкурентен антагонизъм.

Основният прекурсор на разтворимите рецептори е мембранно-свързаният IL-1RP. Афинитетът на rIL-IP към IL-1 и IL-1RA е различен. По този начин, rIL-1RN има по-висок афинитет към IL-1β, отколкото към IL-1RA, а rIL-1PI проявява по-висок афинитет към IL-1RA, отколкото към IL-ip.

Съществуват и два вида разтворими рецептори за TNF - pp55 и pp75, подобно на разтворимите IL-1 рецептори, те се образуват чрез "отделяне". In vivo и двата рецептора се намират в тъканите на засегнатите стави. Ролята на разтворимите TNF рецептори в патогенезата на остеоартрозата е предмет на дискусии. Предполага се, че в ниски концентрации те стабилизират триизмерната структура на TNF и увеличават полуживота на биоактивния цитокин, докато високите концентрации на pp55 и pp75 могат да намалят TNF активността чрез конкурентен антагонизъм. Вероятно pp75 може да действа като TNF носител, улеснявайки свързването му с мембранно-асоциирания рецептор.

Третият клас естествени цитокинови инхибитори е представен от група противовъзпалителни цитокини, които включват TGF-бета, IL-4, IL-10 и IL-13. Противовъзпалителните цитокини намаляват производството на провъзпалителни и някои протеази и стимулират производството на IL-1RA и TIMP.