Експериментална работа върху трансплантация на алогенни кератиноцити върху изкуствено създадени белези на бели плъхове

Желанието за използване на клетъчния потенциал и необходимостта от намиране на нови ефективни методи за подобряване на естетическия вид на белезите доведоха до идеята да се опита да се проучи възможността за трансплантация на кератиноцити върху белези.

За да се докаже вероятността от използване на кератиноцитна култура за подобряване на външния вид на белези, е проведено експериментално изследване върху бели лабораторни плъхове, на които са създадени белезни повърхности. Моделът на белег от плъх е получен в резултат на заздравяване на изкуствено нанесени рани по гърба, по протежение на гръбначния стълб. На плъховете са изрязани идентични парчета кожа с размери 2x3 см. 2,5 месеца след операцията „моделиране на белег“, на плъховете е извършено дермабразио (отстраняване на горните слоеве на белега с помощта на термокаустика) и са трансплантирани алогенни кератиноцити, изолирани от кожата на малките плъхове 2-4 дни след раждането.

Изолирането и култивирането на епидермални клетки от плъхове е извършено в лабораторията по клетъчни технологии на Института по цитология на Руската академия на науките, използвайки следната технология.

Кожата беше измита във физиологичен разтвор на Ханк, съдържащ 200 U/ml гентамицин, и нарязана на малки парченца с площ 0,2-0,5 cm2 ^. Парчетата кожа бяха инкубирани в 0,5% разтвор на диспаза в балансиран солен фосфатно-буферен разтвор при 37°C за 1 час. След това парчетата бяха прехвърлени във фосфатно-буферен физиологичен разтвор на Дулбеко и епидермисът беше отделен от дермата. Епидермисът беше инкубиран в 0,125% разтвор на трипсин за 10-15 минути при разбъркване при 50 rpm, след което действието на ензима беше спряно чрез добавяне на 5% фетален говежди серум. Една трета от получената клетъчна суспензия беше използвана в чист вид за един от вариантите за трансплантация върху белези, втората трета беше отгледана върху биосъвместими домашни филмови покрития "Polypor", а третата - върху петриеви панички без субстрат. Операцията по дермабразио на получените белези при плъхове с последваща трансплантация на епидермални клетки от плъх върху тях беше извършена под етерна анестезия с помощта на термична каутеризация.

При първата група плъхове, след дермабразио, върху полираната, измита с физиологичен разтвор и подсушена повърхност на белега са поставени стерилни парченца батист, върху които е нанесена разклатена суспензия от алогенни епидермоцити на плъхове в концентрация от 1,5 милиона клетки на 1 мл (според Института по цитология). Парчетата батист са поставени върху полирания белег, така че клетките да лежат върху повърхността на белега. Отгоре е поставена превръзка от няколко слоя марля, която е зашита към краищата на белега.

Част от получената клетъчна суспензия беше посята в петриеви панички върху стерилни Polypore филми, изрязани по формата на паничките, а другата част - върху петриеви панички без филм. Култивирането беше проведено в FAD среда, състояща се от смес от DMEM и F12 среда в съотношение 3:1, с добавяне на 10% фетален говежди серум, 5 μg/ml инсулин (Sigma), 0.5 μg/ml хидрокортизон хемисукцинат (Sigma), 10 μg/ml епидермален растежен фактор EGF (Институт по цитология на РАН, Санкт Петербург). Втората и третата група плъхове, по 7 индивида всяка, бяха оперирани 6 дни след първата. По това време от суспензията от посятите кератиноцити в петриевите панички се образуваха многослойни слоеве, които бяха трансплантирани в плъховете. Втората група беше трансплантирана с епидермоцити върху филм, а третата - с многослоен слой без субстрат. След 7 дни получените многослойни слоеве от алогенни кератиноцити (MPALK), посяти върху филмите „Polypore“, бяха трансплантирани като култура директно върху повърхността на раната. Отгоре филмът, за да се избегне разкъсването му, беше фиксиран с многослойна марлена превръзка и зашит към кожата на плъховете.

Преди трансплантацията на кератиноцити на третата група плъхове, отглеждани без субстрат, PAC беше отделен от дъното на петриевата паничка чрез третиране с диспаза, която има способността селективно да разрушава дермално-епидермалните връзки. При действие върху многослоен слой, диспазата разрушава връзката на клетките на базалния слой с дъното на петриевата паничка и има много по-малък ефект върху междуклетъчните връзки, което прави възможно пълното „отстраняване“ на слоя. Отделянето на многослойния клетъчен слой с диспаза беше извършено по следния начин. Транспортната среда беше отцедена от петриевите панички, клетъчните слоеве бяха промити три пъти с хранителна среда, съдържаща антибиотици, по-специално гентамицин (0,2 mg/ml). Многослойните слоеве бяха запълнени с 0,125% разтвор на диспаза („Sigma“) и поставени в термостат, където бяха инкубирани при t=37°C за 20-30 минути. Появата на бял ръб, отлепващ се по периферията на слоя, е индикатор за началото на процеса на отделянето му от краищата и дъното на петриевата паничка. Няколко минути след началото на процеса на отделяне, разтворът на диспаза се отцежда, епителните слоеве се промиват 2-3 пъти със средата. Върху повърхността на епидермалния слой се нанася парче стерилна превръзка за рани „Лита-колор“, изрязано по размера на чашката, към което се залепва слоят, отделен от диспаза, допълнително отлепен от дъното на чашката с шпатула. С помощта на пинсета слоят, заедно с покритието на салфетката „Лита-колор“ (Русия), се откъсва от дъното на петриевата паничка и внимателно се пренася върху подготвената повърхност на белега. Салфетките „Лита-колор“ съдържат гентамицин и екзолин (екстракт от колаген), които при навлажняване с остатъците от растежната среда и след това с физиологичен разтвор набъбват и се превръщат в модерна превръзка за рани, осигуряваща добра защита от външна инфекция и бързо заздравяване благодарение на влагоабсорбиращата структура.

Върху Polypore филмите и Lita-color салфетките бяха поставени многослойни марлени превръзки и зашити към кожата на плъховете за по-силна фиксация. Всеки плъх беше поставен в отделна клетка, за да се създадат оптимални условия за неговото поддържане и присаждане на трансплантираните кератиноцити. Превръзките на плъховете, на които бяха трансплантирани суспензията и многослойният слой от епидермоцити, отстранени чрез диспаза, бяха навлажнявани със стерилен физиологичен разтвор няколко пъти на ден, за да се създадат най-благоприятни условия за присаждане на клетките. Като се има предвид, че Polypore филмът беше непропусклив за вода, превръзките на плъховете от втората група не бяха навлажнявани, което беше едно от предимствата пред трансплантациите без филми. Превръзките бяха отстранени след 10 дни. Клиничната картина на белезите след клетъчна трансплантация се различаваше малко от белезите без трансплантация, с изключение на по-розовия им цвят (поради дермабразио) и по-голямото лющене. Този факт предполага, че веднага след като превръзките на раната паднаха с MPC, не настъпиха промени в белега.

Вземане на биопсичен материал от плъхове.

След 1, 2, 5 и 9 месеца след трансплантацията на алогенни кератиноцити от плъхове върху полирани белези на бели плъхове, е взет материал за хистологично, цитоморфологично и електронно-микроскопско изследване. Като контрола са взети проби от нормална кожа на плъхове и белег без клетъчна трансплантация. Анестезията на плъховете е извършена с етерна анестезия.

След анестезия от маркираните зони бяха взети парченца белегова тъкан, в които с помощта на биопсичен перфоратор с диаметър 2 мм бяха трансплантирани кератиноцити и поставени в 2,5% разтвор на глутаралдехид за подготовка на материала за електронно-микроскопско изследване. Парчета тъкан, взети за хистологично изследване, бяха поставени в 10% неутрален разтвор на формалин, последвано от преминаване през алкохоли и заливане с парафин, последвано от изрязване на ултратънки срезове и разглеждането им в светлинно-оптичен микроскоп.

Контрола I. Нормална кожа на плъх.

За да се види разликата между микроскопската картина на нормална кожа на плъх с белези и белези в определени моменти след трансплантацията на MPC, на всички етапи от това проучване са показани техни снимки и описания.

Епидермисът на нормалната кожа се състои от 7-9 слоя клетки. Роговият слой е с умерена дебелина. На места се състои от 6-8 слоя рогови люспи. Базалният слой е представен от цилиндрични клетки с големи, леки, с правилна форма ядра и няколко ядърца. Дезмозомните връзки между клетките и с базалната мембрана са ясно изразени. Под добре очертаната базална мембрана, която има малки израстъци в субепидермалния слой, успоредно на нея лежат нежни снопчета колагенови и еластинови влакна, сред които са удължени фибробласти, малки съдове. В по-дълбоките слоеве снопчета колагенови и еластинови влакна лежат в различни посоки. Сред тях са много съдове с тънки стени от един и същи калибър, клетъчни елементи (фибробласти, мастоцити, левкоцити). Голям брой космени фоликули, мастни жлези.

Контрола 2. Белег от плъх, на 2 месеца.

Клинична картина. Белезите са бледорозови, с лющене, на места остават корички. Площта им е намаляла поради свиване на колагеновите влакна и е станала приблизително 3,0-3,5 см ^:. Кожните придатъци липсват.

Микроскопска картина. Епидермисът се състои от 3-5 слоя клетки, нагънати, представени от заоблени базални клетки, един ред шиловидни, 1-2 реда гранулирани с кератохиалинови зърна в горния слой, има области на вътреклетъчен оток. Роговият слой е неравномерно променен от много тънък до удебелен. Наблюдава се нагъване на белега поради (свиване) на белегова тъкан. Гънките проникват до папиларния слой и създават впечатление за папили. Границата между епидермиса и дермата е права линия. Базалната мембрана не се проследява навсякъде. В долната част на субепидермалния и по-дълбоките слоеве има съдове с дебела, разхлабена стена, много от тях са пусти, със застой. Около съдовете има струпване на макрофаги, фибробласти. Макрофагите обграждат еритроцитите, освободени от капилярите, и ги фагоцитират. В по-повърхностните слоеве има малки капиляри. Под епидермиса колагеновите влакна са разположени свободно. В по-дълбокия слой на белега има груби снопове от колагенови влакна, сред които има много фибробласти.

Белег от плъх един месец след трансплантация на кератиноцити от плъх.

Клинична картина. Белезите са розови, площта им е намаляла, особено в диаметър, и е средно 2,5-3 см ^2. Липсват косми и мастни жлези.

Данните от микроскопското изследване на материала, получен от плъхове с трансплантация на MPaLK върху филм и MPaLK без субстрат, са практически идентични. Чисто технически обаче работата с MPaLK без субстрат е много по-сложна и старателна, отколкото при отглеждане на MPaLK върху субстрат, следователно, при по-нататъшно изучаване на въпроса за трансплантацията на кератиноцити в белези, използвахме многослоен батист като основа за отглеждане („субстрати“).

Микроскопска картина. Отбелязва се удебеляване на епидермиса до 15-20 слоя, почти до средата на които кератиноцитите имат тясна, удължена, вертикална форма и компактно разположение. Базалните клетки са разположени в неравна линия. Ядрата им са светли, големи, заоблени с едно или две ядреца, което показва високата им синтетична и пролиферативна активност. Границата между епидермиса и дермата е права линия. Шиповидният слой е добре развит, състои се от 3-5 слоя заоблени клетки, има 2-ядрени клетки.

Непосредствено под базалната мембрана има гъсто разположени тънки снопчета колагенови влакна, успоредно на тях има голям брой пусти съдове, по-дълбоките колагенови влакна са по-груби, събрани в плътни снопчета. Много големи фибробласти, мастоцити (2-3 в зрителното поле), макрофаги, левкоцити и пусти съдове, чиито стени са разхлабени, около тях има свободно разположени колагенови влакна. В някои съдове има стаза, диапедеза на образуваните елементи. Около съдовете има фибробласти, единични лимфоцити. Кожните придатъци липсват.

При трансплантация на кератиноцитна суспензия върху полиран белег, микроскопската картина се различава от предишната. При повечето животни епидермисът е тънък и се състои от 5-6 слоя клетки. Долният слой се състои от клетки с неправилна, многоъгълна форма с ядра със закръглена до неправилна форма. Състоянието на субепидермалния слой е подобно на състоянието му в групата животни без MPALK трансплантация.

В този случай можем да говорим или за забавяне на процесите, съпътстващи клетъчната трансплантация, или за голяма загуба на клетки, трансплантирани под формата на суспензия. Следователно е направено заключение за нецелесъобразността на корекцията на белези чрез трансплантация на кератиноцити под формата на суспензия.

Белег от плъх 2 месеца след трансплантация на кератиноцити от плъх.

Клинична картина. Белегът изглежда тънък и деликатен. На места се наблюдават лющене и лющещи се петна.

Микроскопска картина. Роговият слой е удебелен, на места - хиперкератоза. Епидермисът е удебелен, състои се от 12-20 реда клетки. Границата между епидермиса и дермата е права линия. Деликатните колагенови влакна под епидермиса лежат доста гъсто. В по-дълбоките слоеве на белега те са събрани в големи груби снопове. В субепидермалния слой се появяват нови съдови образувания. В долните слоеве на белеговата тъкан има много безлюдни съдове, разположени успоредно на повърхността на епидермиса. Големи фибробласти са равномерно разпределени в дебелината на белега, има гигантски, многоразклонени, много макрофаги.

Белег от плъх 5 месеца след трансплантация на епидермални клетки от плъх.

Клинична картина. Белегът изглежда равномерен, гладък, без лющене, има единични косми, гъстотата им е по-голяма по периферията на белезите, което показва маргинално врастване на космените фоликули в белега и новообразуване на космени фоликули. Площта на белезите продължава да намалява.

Микроскопска картина. Епидермисът е все още дебел (15-20 слоя, на места до 30), в горните слоеве е изпълнен с кератохиалинови зърна. Базалната мембрана е ясно видима. Под нея колагеновите влакна лежат свободно. В долните слоеве колагенът е по-мощен и плътно опакован. Между колагеновите снопчета има много капиляри. В горните слоеве броят на пустите съдове е намалял. Преходът между епидермиса и дермата е леко вълнообразен. На места има дълбоки епидермални израстъци в белегова тъкан. Между колагеновите влакна се виждат новообразувани съдове. Появяват се единични космени фоликули и мастни жлези.

Белег от плъх 9 месеца след трансплантация на епидермални MPA клетки от плъх.

Клинична картина. Белезите са станали значително по-малки по размер в сравнение с по-ранни периоди, площта им е средно около 1,5-2,0 см² ^. Белезите са неравномерно покрити с фини косми, особено по периферията. Остава леко фино-пластиново лющене.

Микроскопска картина.

Епидермисът е станал по-тънък, представен е от 6-8 реда клетки, наподобява по структура епидермиса на нормална кожа на плъх, само че плътността на клетките е с 1 мм по-висока и те са по-малки. Базалният слой се състои от малки кръгло-цилиндрични клетки. Базалната мембрана е добре изразена, хемидесмозомите са ясно видими. Отбелязва се наличието на епидермални израстъци в субепидермалния слой. Папиларният слой е изразен по цялата дължина на белега. Тези факти показват, че до този момент адхезията на трансплантираните кератиноцити е станала много по-силна с подлежащите белегови тъкани. Следователно, грижата за белега при хора с MPALK трансплантация 9 месеца след MPC трансплантация може да бъде традиционна. Под епидермиса колагеновите влакна са по-деликатни, отколкото в дълбоките слоеве. Появили са се много съдове, особено повърхностните. Стените на по-големите съдове са удебелени. Космените фоликули и мастните жлези са в големи количества. Микроскопската картина наподобява дермоподобна тъкан.

Резултати от експерименталната работа и тяхното обсъждане.

В хода на тази работа, кератиноцити в различни форми бяха трансплантирани върху изкуствено създадени белези от кожа на плъх след дермабразио - върху раневи покрития, като суспензия върху батист и като многослоен слой без субстрат. Работата е проведена с цел получаване на морфологични данни за ефекта на трансплантираните алогенни кератиноцити върху белези, както и определяне на оптимални варианти за трансплантация.

Установено е, че и трите метода на трансплантация са осъществими, но трансплантацията на MPAC без субстрат е много трудоемка процедура, по време на която MPAC може да бъде увреден, което се отразява на резултатите от трансплантацията. Освен това, този метод на трансплантация изключва работа върху големи повърхности.

Трансплантацията на кератиноцитна суспензия е много по-рентабилен метод, не изисква дългосрочно култивиране на клетки и е опростен в предлагания от нас вариант, използващ стерилни батистови заготовки, чиито размери съответстват на размера на белезите. Забавянето на терапевтичния ефект при трансплантация на клетъчна суспензия с около месец в сравнение с МПК върху ранево покритие не е съществен момент при продължителност на лечението от много месеци. Известно е, че когато МПК се трансплантира на пациенти с изгаряния, трансформацията на кожната структура настъпва постепенно и в продължение на няколко години. Трансплантацията на кератиноцитна култура върху раневи покрития е най-удобният и обещаващ метод, но и значително по-скъп. Освен това, в момента се изисква търсене на по-модерни варианти за покритие, които да са гъвкави, хигроскопични, да имат бактериостатични или бактерицидни свойства и да са биологично неутрални за клетките. Филмът "Polypor" - междинен вариант на домашното филмово покритие за рани, въпреки някои несъвършенства, ни позволи да проучим в експеримента трансплантацията на кератиноцити от плъхове върху белези и да направим изводи за ефективността на тази посока на лечение на белези.

Авторите, които са трансплантирали МПК върху рани от изгаряния, отбелязват, че през първата седмица след трансплантацията на многослоен слой кератиноцити върху санирани рани, епидермисът се удебелява и стратифициран. Всички слоеве на епидермиса са ясно видими. Интересното е, че броят на клетъчните слоеве в трансплантатите е с 10-30% по-голям, отколкото в кожните биопсии. Авторите отбелязват появата на кератохиалинови гранули на 5-ия ден след трансплантацията на МПК, а на базалната мембрана и хемидесмозомите - още на 3-ия ден.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) установяват, че в ранните етапи след трансплантация на MPC на пациенти с кожни дефекти с пълна дебелина след изгаряния, връзката между дермата и епидермиса е много слаба и представлява права линия, папиларният слой липсва. До края на втория месец започват да се образуват плитки папили и кожни придатъци, връзката между дермата и епидермиса се засилва. Литературните данни показват, че трансплантацията на алогенни кератиноцити върху рани при пациенти с изгаряния е обещаващ метод. Въпреки факта, че отхвърлянето на алогенните кератиноцити се случва, според различни автори, в рамките на 10 дни до 3 месеца, те въпреки това играят своята роля в заздравяването на раневата повърхност, секретирайки растежни фактори и механично затваряйки дефекта. Смята се, че MPALC имат намалена антигенна активност, тъй като по време на култивирането in vitro губят Лангерхансови клетки, което им позволява да съществуват в тялото на реципиента дълго време. Освен това, алогенна култура, получена от кожата на млади здрави хора, има несравнимо по-голям биологичен потенциал от автоложна култура на пациенти след травма.

Основната цел на нашето проучване беше да установим дали алогенните кератиноцити ще се прикрепят към белези и какви промени ще настъпят в белеговата тъкан под въздействието на такова биологично активно „покритие за рани“. В случай на положителен резултат, да разработим най-ефективната и най-малко трудоемка технология за тази област на рехабилитационната медицина.

Получените от нас данни в много отношения бяха сходни с литературните данни за морфологичните промени, настъпващи в човешкия епидермис след трансплантация на алогенни кератиноцити в рани от изгаряния. Съществуват обаче и съществени разлики, както по отношение на морфологичния субстрат, върху който се извършва трансплантацията, така и по отношение на технологията. По този начин, процесът на образуване на базалната мембрана и дермално-епидермалните връзки (хемидесмозоми, папили) протича на по-късен етап в сравнение с трансплантацията на кератиноцити върху раневи повърхности без белези. Очевидно това се дължи на по-лошото хранене на белеговата тъкан в сравнение с дермата или мускулната фасция. Белегът, особено старият, е плътна съединителна тъкан с много малък брой съдове, докато дъното на раната от изгаряне е гранулационна тъкан, богата на съдове. По този начин е очевидно, че условията, при които протичат трансплантацията и присаждането на кератиноцитите, са абсолютно различни. Колкото по-васкуларизирана е зоната на клетъчна трансплантация, толкова по-лесен е процесът на тяхното присаждане. От този постулат следва заключението за предпочитането на работа с млади белези, при които съединителната тъкан е все още доста рехава и богата на съдове.

В резултат на тази експериментална работа беше доказано, че:

1. Трансплантация на MPALK върху белези е възможна.
2. Оптималният метод за трансплантация е трансплантацията на кератиноцити върху раната.
3. Повърхността на белега трябва да се полира с помощта на хирургично лазерно дермабразио или нож на Шуман.
4. Под влияние на MPALK настъпва бърза епителизация на полираната повърхност на белега.
5. Колкото по-добре е васкуларизирана белеговата тъкан, т.е. колкото по-млад е белегът, толкова по-добри са резултатите от трансплантацията на кератиноцити.
6. Под влияние на трансплантираните кератиноцити, белеговата тъкан постепенно се трансформира и се превръща в дермоподобна (по-рехава белегова тъкан с кожни придатъци).
7. Постепенно разхлабване на белеговата тъкан, започвайки от субепидермалния слой. Подобрява се васкуларизацията ѝ, снопчетата колагенови влакна в горната и долната част на белега заемат по-рехаво разположение, отколкото в белеговата тъкан без клетъчна трансплантация. Появяват се космени фоликули и мастни жлези. Епидермисът, по своята структура, след като е преминал фазата на хипертрофия, се доближава до епидермиса на нормалната кожа.
8. Наблюдаваните промени са свързани с растежни фактори и цитокини, секретирани от кератиноцитите, които, чрез подобряване на трофиката на белеговата тъкан, насърчават нейната трансформация от груба фиброзна тъкан в по-рехава тъкан, което води до подобряване на външния вид на белега.

Следователно, въз основа на това проучване може да се заключи, че трансплантираните кератиноцити имат благоприятен ефект върху белеговата тъкан, което може да има практически последици за рехабилитацията на пациенти с различни видове белези.

Тази работа върху плъхове ни позволи да формулираме и изискванията за покрития за рани, върху които се отглеждат кератиноцити.

Превръзките за рани трябва да бъдат:

• биосъвместим с клетките,
• дишащ,
• имат еластична, оформяща се основа,
• да бъде хидрофилен,
• като лекарствени добавки съдържат антибактериални лекарства и антиоксиданти, които не са токсични за култивираните клетки.

Клинични резултати от биотехнологично лечение на белези.

Преди това, Н. Карвър и др. (1993) установиха, че оклузивните превръзки най-добре насърчават прикрепването към раната и оцеляването на кератиноцитите, но не позволяват образуването на стратифициран (зрял) епидермис. За образуването на стратифициран епидермис е необходима въздушна среда. Следователно, след прикрепването на многослоен слой, беше предложено оклузивната превръзка за рани да се премахне след 7-10 дни и раните да се лекуват със сухи превръзки или водоразтворими мехлеми. Може да се каже, че качеството и свойствата на „субстрата“, върху който се отглеждат клетките, са много важен момент за ефективността на трансплантацията на клетъчен материал и следователно за резултатите от работата на лекарите. Но днес няма идеална превръзка за рани, въпреки изобилието от предложени варианти (изкуствена кожа, нетъкан текстил от карбоксиметилцелулоза, фибринови покрития, полупропускливи полиуретанови филми). Важен момент в този въпрос е цената на „субстратите“ (специални покрития за рани), тъй като високата им цена увеличава общата цена на биотехнологичното лечение.

Ефективността на клетъчните технологии е доказана до момента, но за съжаление тези технологии са много скъпи, особено в страни, където не е установено индустриално производство на клетъчни състави. Страни като Съединените щати обаче отдавна са създали индустрия за производство на клетъчен материал за трансплантация на изгаряния. По-специално, компанията BioSurface Technology Inc. от 1989 г. насам е отгледала 37 000 многослойни слоя кератиноцити, които са използвани за лечение на 240 пациенти в 79 страни по света (R. Odessey, 1992), докато 1 cm 2 клетъчна ^{култура} струва около 7-8 щатски долара.

Технологията за лечение на различни кожни заболявания и проблеми има редица разлики, но всяко клетъчно лечение се основава на получаване на висококачествен клетъчен материал и неговата трансплантация.

Този процес се състои от следните стъпки:

• вземане на кожа от жертви (или от донори),
• транспортиране на кожни ламели до биотехнологичен център,
• изолиране на клетки от базалния слой и тяхната пролиферация,
• растеж на многослойни кератиноцитни слоеве (MLK).
• трансплантация на клетъчна култура.

Основният проблем при провеждането на лечение чрез трансплантация на многослойни кератиноцитни листове е необходимостта от жизнеспособни клетки на всички етапи на клетъчната трансплантация. Парчетата кожа за изолиране на автоложни или алогенни клетки трябва да бъдат възможно най-тънки, тъй като в този случай те са по-лесни за отделяне с помощта на механични и ензимни методи и получаване на суспензия от живи клетки за култивиране. Те могат да бъдат получени чрез изрязване с дерматом или чрез използване на кожата на клепачите, препуциума и вътрешната повърхност на рамото. Като се има предвид, че клетките са чувствителни към халогени (хлор, йод), водороден пероксид, те не могат да се използват при обработка на кожата по време на вземане на материал.

Количественият и качествен добив на клетки от кожни присадки и ефективността на тяхното култивиране също зависят от здравето и възрастта на донора. Освен това, кожните биопсии трябва да бъдат доставени възможно най-бързо и при подходящи условия (околна среда, температура) в сертифицирана и акредитирана за тези цели лаборатория.

За съхранение и транспортиране на кожни ламба може да се използва среда на Игъл или среда 199 с добавка на 10% говежди серум, DMEM среда с добавка на 5% фетален говежди серум и антибиотици.

В цитологичната лаборатория кожната биопсия първо се разделя механично на малки парченца, след което парченцата кожа се обработват с помощта на ензими: трипсин, колагеназа, диспаза и др.

Под действието на ензимите, десмозомите се разрушават и кератиноцитите се освобождават в средата под формата на отделни клетки или агрегати, състоящи се от различен брой клетки. За култивиране се използват само базални кератиноцити, които се отглеждат върху специални среди в термостати, съдържащи 5% CO2, в петриеви панички или в колби при t = 37°C. Вече след 48 часа се наблюдава образуването на колонии от кератиноцити, които постепенно се сливат, за да се превърнат в монослой. След получаване на достатъчен брой клетки, получената суспензия се посява върху подготвени за тази цел превръзки за рани и се поставя в петриеви панички. Първо от суспензията се образува монослой, а след това многослоен слой кератиноцити. Етапите на процеса на култивиране на кератиноцити са схематично показани на фиг. 12 (33,43,54,65).

Образуването на многослоен кератиноцитен слой, подходящ за трансплантация, обикновено отнема 7-10 дни. Понякога този период е по-дълъг, което зависи от качеството на изходния материал (възраст, здравословно състояние на донора, коректност на вземането на материала, качество на използваната среда и др.). Ако многослойният слой прекомерно се разрасне, тогава на повърхността му могат да се появят клетки с явления на апоптоза, неподходящи за трансплантация. Петриеви панички с отгледани в тях върху раневи покрития многослойни кератиноцитни слоеве (MLK) се доставят в клиниката в специални контейнери при температура най-ниска +15° C.

Модифициран метод на Грийн за отглеждане на MPC

В нашата работа използвахме многослоен батист като покритие за рани, изоставяйки филмите "Polypor", с които започнахме работа в експеримента с плъхове. По този начин, ние отгледахме многослойни слоеве кератиноцити върху предварително обезмаслен и стерилен батист, въпреки че той също не е оптимално покритие за рани.

Клиничните проучвания са проведени върху доброволци при спазване на необходимите етични стандарти: подписване на споразумение и информирано съгласие.

1. Използвана е култура от собствени (автоложни) и банкирани (алогенни) кератиноцити на пациента.
2. Собствените кератиноцити на пациентите са получени от парче кожа, изрязано от вътрешната страна на горната част на ръцете им.
3. Дермабразиото на белези е извършено с помощта на термокаутеризация, ротационни дискове и ербий лазер.
4. Взети са групи пациенти с нормотрофични, хипотрофични и хипертрофични белези.

Технологичният процес за прилагане на клетъчна технология за подобряване на външния вид на кожни белези се състоеше от следните етапи:

1. Избор на пациент.
2. Обяснения на същността на лечението, времевата рамка за получаване на очаквани резултати, подписване на договор и информирано съгласие.
3. Предписвайте на пациентите 2-3 седмици преди операцията селмевит по 1 таблетка 3 пъти дневно, цинктерал по 1 таблетка 3 пъти дневно.
4. Вземане на парче кожа с дължина 2,0 см и ширина 0,7-1,0 см от вътрешната повърхност на рамото, високо, почти в долната част на аксиларната област, за получаване на автоложни кератиноцити.
5. В случаите, когато пациентите отказват да им се изолират собствени кератиноцити поради възможността от линеен белег по вътрешната повърхност на рамото, е взет клетъчен материал от клетъчна банка (алогенни кератиноцити).
6. Кератиноцитите бяха изолирани и култивирани в лаборатория, сертифицирана за този вид работа.
7. След получаване на достатъчно количество MPC за трансплантация върху белезите, в клиниката беше определен ден за операцията, където материалът беше донесен в специални контейнери в петриеви панички.
8. Извършена е операция за дермабразио на белег, хемостаза, полираната повърхност е измита със стерилен физиологичен разтвор, изсушена е, след което МПК са трансплантирани върху нея върху стерилен батист „клетките надолу“. Тоест, клетките, които са били по-горе в МПК, се оказали по-ниски, в съседство с полираната повърхност.
9. Отгоре се поставя стерилен филм, който се фиксира към кожата с еластична превръзка или еластичен пластир Omnifix. Вместо филма могат да се използват индиферентни превръзки за рани, съдържащи силикон, например Mepitel, Mepiform, силиконови гел листове.

След 5-7 дни филмът или силиконовото покритие се отстранява. До този момент всички кератиноцити би трябвало да са се покатерили по полирания белег и да са се прикрепили към повърхността му.

10. Влажната среда, създадена под филма и силиконовото покритие, активно допринася за това. Останалият върху белега батист може да се напои с куриозин или хитозанов гел. В резултат на това на втория ден се създава плътна кора, която за удобство на пациента е най-добре да се фиксира с еластичен, дишащ пластир, като например Omnifix. Дишащата кора позволява на образувания епидермис да се диференцира и да се превърне в зрял.

В зависимост от вида на белега и дълбочината на шлифоване, превръзката се отхвърля след 8-10 дни. По това време епидермисът има 30-40% повече клетъчни слоеве, отколкото в нормалната кожа. Базалната мембрана не е образувана. Кератиноцитите на удебеления епидермис отделят много биологично активни молекули в белеговата тъкан.

Успехът на биотехнологичното лечение на белези до голяма степен зависи от метода на грижа в следоперативния период. Клетъчните култури са „нежен“ вид покритие на рани и в ранните етапи след трансплантацията, ИПЦ могат лесно да се отлепят от подлежащите тъкани. Поради това на пациентите се препоръчва внимателно да боравят с белега след операцията. В продължение на 8-9 месеца не търкайте и третирайте внимателно със студена преварена вода, за да избегнете разкъсване на тънкия, новосъздаден епидермис, който няма плътна връзка с подлежащите тъкани.

Забележка.

Преди операция и по време на дермабразио е допустимо използването на халогенирани антисептици и окислители (йодопирон, сулиодопирон, йодинол, йодинат, хлорхексидин, водороден пероксид), преди клетъчна трансплантация - е строго противопоказано поради цитотоксичен ефект. Метиленовото синьо и брилянтното зелено също са токсични за клетките.

За да се избегне инфекция, особено при работа с хипертрофични белези, хирургичното поле може да се третира с неомицин сулфат, полимиксин или гентамицин. Те нямат цитотоксичен ефект върху кератиноцитите.

В резултат на такова лечение се постига троен ефект.

1. Изравняване на повърхността на белега.
2. Създаване на слой от нов епидермис с нормална дебелина над него.
3. Трансформация на белегова тъкан в дермоподобна тъкан поради действието на цитокини, растежни фактори и други биологично активни молекули, секретирани от трансплантирани клетки и стимулирани от тях кератиноцити, фибробласти и макрофаги.

Белегът става по-малко забележим, по-еластичен, в него се появяват пори и пухкави косми, а пигментацията може да се възстанови поради наличието на меланоцити в IPC.

Всички тези положителни аспекти на белега обаче не се проявяват веднага. В тази връзка е необходимо пациентите да бъдат предупредени, че процесът на трансформация на белеговата тъкан в дермална тъкан протича бавно и оптималният резултат от такова лечение може да се очаква не по-рано от 10-14 месеца. Веднага след отхвърлянето на превръзките, полираните повърхности имат изразена полихромия, колкото по-ярка е, толкова по-дълбоко е извършено полирането. Най-малко увреждане на кожата се наблюдава при полиране на нормотрофични белези с ербий лазер. Цветът на белезите и околната кожа се възстановява в рамките на 3 до 8 седмици. Въпреки тези предпазни мерки, понякога се появява следоперативна хиперпигментация, която може да изчезне сама в рамките на няколко месеца.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]