Ролята на кристалните отлагания в патогенезата на остеоартрита

Кристали на основен калциев фосфат (BCP) се откриват в синовиалната течност на 30-60% от пациентите с остеоартрит. Според A. Swan et al. (1994), кристали, съдържащи калций, се откриват в синовиалната течност на много по-голям брой пациенти с остеоартрит; поради изключително малкия размер на кристалите или малкия им брой, те не се идентифицират с помощта на конвенционални техники. Наличието на кристали на BCP в синовиалната течност корелира с рентгенографски признаци на дегенерация на ставния хрущял и е свързано с по-голям обем излив в сравнение с излив в колянни стави без кристали. Проучване на факторите, влияещи върху рентгенографската прогресия на гонартрозата, показа, че отлагането на кристали калциев пирофосфат дихидрат (CPPD) е предсказващ фактор за неблагоприятен клиничен и рентгенографски резултат. В проучване на пациенти в напреднала възраст е установено, че остеоартритът е свързан с хондрокалциноза, особено в латералния тибиофеморален компартмент на коляното и първите три метакарпофалангеални стави. Не е необичайно и двата вида кристали, OFC и PFC, да се открият при пациенти с остеоартрит.

Клинично, дегенерацията на ставния хрущял, причинена от отлагане на калциеви кристали, се различава от тази, наблюдавана при първична остеоартроза. Ако кристалите бяха просто епифеномен на дегенерация на хрущял, те щяха да се откриват в ставите, най-често засегнати от първична остеоартроза, т.е. коленете, тазобедрените стави и малките стави на ръцете. За разлика от тях, заболяванията с отлагане на кристали най-често засягат стави, които не са типични за първична остеоартроза, като рамото, китката и лакътя. Наличието на кристали в ставната (ефузионна) течност е свързано с по-тежка дегенерация на ставния хрущял. Въпросът кое е причината и кое е следствието, отлагането на кристали или дегенерацията на хрущяла, е обект на дискусии. Междинно положение заема следното предположение: първична аномалия в метаболизма на хрущяла води до неговата дегенерация, а вторичното отлагане на кристали ускорява неговото разграждане (т.нар. теория на амплификационната бримка).

Точният механизъм, чрез който калциевите кристали увреждат ставния хрущял, е неизвестен и е обобщен по-долу. Теоретично, калциевите кристали могат директно да увреждат хондроцитите. Хистологичното изследване обаче рядко разкрива кристали в близост до хондроцитите и още по-рядко те се поглъщат от тях. Най-вероятният механизъм е фагоцитоза на кристали от клетки на синовиалната обвивка, последвана от освобождаване на протеолитични ензими или секреция на цитокини, които стимулират освобождаването на ензими от хондроцитите. Тази концепция се подкрепя от проучване на ролята на индуцирания от PFKD синовит в развитието на бързо прогресираща остеоартрит при пирофосфатна артропатия. В това проучване кристали калциев пирофосфат дихидрат (1 или 10 mg) са инжектирани ежеседмично в дясното коляно на зайци с остеоартрит, индуциран от частична латерална менисектомия. Оказа се, че след 8 инжекции дясната колянна става показва значително по-сериозни промени в сравнение с лявата. Интензивността на синовиалното възпаление корелира с вътреставните инжекции на кристали калциев пирофосфат дихидрат и тяхната доза. Въпреки факта, че дозите на CPPD кристали, използвани в това проучване, надвишават тези in vivo, резултатите показват ролята на индуцираното от CPPD възпаление в прогресията на остеоартрита при пирофосфатна артропатия.

Потенциалните механизми за индуциране на увреждане на ставния хрущял от калций-съдържащи кристали са свързани с техните митогенни свойства, способността да индуцират MMP и да стимулират синтеза на простагландини.

Митогенен ефект на калций-съдържащи кристали. При кристално-асоциирани артропатии често се наблюдава пролиферация на клетки на синовиалната обвивка, като самите кристали са само частично отговорни за този процес. Увеличаването на броя на синовиалните клетки е съпроводено с повишена секреция на цитокини, които насърчават хондролизата и индуцират секрецията на протеолитични ензими. Кристалите OFC в концентрации, открити в човешката ставна патология, дозозависимо стимулират митогенезата на култури от фибробласти на кожата в покой и синовиални фибробласти при кучета и мишки. Кристалите на калциев пирофосфат дихидрат, урат, сулфат, карбонат и калциев фосфат стимулират клетъчния растеж. Началото и пикът на включване на ( ^3H )-тимидин, индуцирано от тези кристали, са изместени с 3 часа в сравнение със стимулирането на клетките с кръвен серум. Този период от време може да е необходим за фагоцитоза и разтваряне на кристалите. Добавянето на контролни кристали със същия размер (напр. диамантен прах или латексови частици) не стимулира митогенезата. Кристалите на натриев урат монохидрат имат слаби митогенни свойства и са значително по-лоши от тези на калциевия урат, което показва значението на съдържанието на калций в кристалите в митогенезата. Синтетичните OFC кристали имат същите митогенни свойства като кристалите, получени от пациенти с хондрокалциноза. Митогенният ефект на калций-съдържащите кристали не е резултат от повишаване на съдържанието на калций в околната хранителна среда in vitro, тъй като разтварянето на основни кристали калциев фосфат в хранителната среда не стимулира включването на ( ^3H )-тимидин от фибробластите.

Един предложен механизъм за митогенеза, индуцирана от OFC, е, че анормалната пролиферация на синовиалните клетки може да се дължи, поне отчасти, на ендоцитоза и вътреклетъчно разтваряне на кристали, което увеличава цитоплазмените концентрации на Ca2 ⁺ и активира калций-зависимия път, водещ до митогенеза. Тази концепция се подкрепя от изискването за директен клетъчно-кристален контакт за стимулиране на митогенезата, тъй като излагането на клетъчни култури на кристали индуцира клетъчен растеж, докато излагането на клетки, лишени от такъв контакт, не го прави. За да се изследва изискването за кристална фагоцитоза след клетъчно-кристално взаимодействие, клетките са култивирани с ⁴⁵ Ca-OPC и ( ^3H )-тимидин. Установено е, че клетки, съдържащи ⁴⁵ Ca-OPC, включват значително повече ( ^3H )-тимидин от клетките без основно маркиране с калциев фосфат. В макрофагните култури, инхибирането на кристалната ендоцитоза от цитохалазин води до инхибиране на разтварянето на кристали, което допълнително подчертава необходимостта от фагоцитоза.

Кристалите, съдържащи калций, са разтворими в киселина. След фагоцитоза, кристалите се разтварят в киселинната среда на макрофагните фаголизозоми. Хлорохинът, амониевият хлорид, бафиломицин А1 и всички лизозомотропни агенти, които повишават лизозомното pH, дозозависимо инхибират вътреклетъчното разтваряне на кристали и усвояването на (3H)-тимидин ^във фибробласти, култивирани с основни кристали калциев фосфат.

Добавянето на OFC кристали към монослойна фибробластна култура предизвиква незабавно десетократно увеличение на вътреклетъчния калций, който се връща до изходното си ниво след 8 минути. Източникът на калций е предимно извънклетъчен йон, тъй като основните кристали калциев фосфат са добавени към хранителна среда без калций. Следващото увеличение на вътреклетъчната концентрация на калций се наблюдава след 60 минути и продължава поне 3 часа. Тук източникът на калций са фагоцитирани кристали, разтворени във фаголизозоми.

Установено е, че митогенният ефект на OFC кристалите е подобен на този на PDGF като растежен фактор; подобно на последния, OFC кристалите проявяват синергизъм с IGF-1 и кръвната плазма. Блокирането на IGF-1 намалява клетъчната митогенеза в отговор на OFC. PG Mitchell et al. (1989) показват, че индуцирането на митогенеза във фибробластите Balb/c- _{3 T3от} OFC кристали изисква наличието на серин/треонин протеин киназа C (PKC), един от основните медиатори на сигналите, генерирани по време на външна стимулация на клетките с хормони, невротрансмитери и растежни фактори. Намаляването на PKC активността в Balb/c-3 T3 клетки _{инхибираOFC} -медиираната индукция на протоонкогените c-fos и c-myc, но не влияе върху стимулирането на тези онкогени, медиирано от PDGF.

Увеличаването на вътреклетъчния калций след разтваряне на фагоцитирани кристали не е единственият сигнален път за митогенезата. Когато растежни фактори като PDGF се свържат с мембранния си рецептор, се стимулира фосфолипаза С (фосфодиестераза), която хидролизира фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат, за да образува вътреклетъчните посредници инозитол-3-фосфат и диацилглицерол. Първият освобождава калций от ендоплазмения ретикулум чрез модулиране на активността на калций-зависимите и калций/калмодулин-зависимите ензими като протеин кинази и протеази.

Р. Ротенберг и Х. Чеунг (1988) съобщават за повишено разграждане на фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат от фосфолипаза С в синовиални клетки на зайци в отговор на стимулация с OFC кристали. Последните значително повишават съдържанието на инозитол-1-фосфат в клетки с белязан ( ^3H )-инозитол; пикът е достигнат в рамките на 1 минута и се задържа около 1 час.

Диацилглицеролът е потенциален активатор на калциев пирофосфат дихидрат. Тъй като OFC кристалите повишават активността на фосфолипаза C, което води до натрупване на диацилглицерол, следователно може да се очаква повишаване на активирането на PKC. PG Mitchell et al. (1989) сравняват ефектите на OFC кристалите и PDGF върху синтеза на ДНК от Balb/c- _{3T3фибробласти}. В клетъчна култура PKC е инактивиран чрез инкубация на клетки с тумор-поддържащ форболов диестер (TPD), диацилглицеролов аналог. Дългосрочната стимулация с ниски дози TPD намалява активността на PKC, докато еднократна стимулация с висока доза я активира. Стимулирането на синтеза на ДНК от OFC кристали е потиснато след инактивиране на PKC, което показва значението на този ензим в OFC-индуцираната митогенеза. Преди това GM McCarthy et al. (1987) демонстрират връзка между митогенния отговор на човешките фибробласти към OFC кристали и активирането на PKC. Въпреки това, OFC кристалите не активират фосфатидилинозитол 3-киназа или тирозин кинази, което потвърждава, че механизмът на клетъчно активиране от OFC кристали е селективен.

Клетъчната пролиферация се контролира от група гени, наречени прото-онкогени. Протеините foe и mye, продукти на прото-онкогените c-fos и c-myc, са локализирани в клетъчното ядро и са свързани със специфични ДНК последователности. Стимулирането на 3T3 фибробласти с OFC кристали води до експресия на c-fos в рамките на няколко минути, която достига максимум 30 минути след стимулацията. Индукцията на c-myc транскрипция от OFC кристали или PDGF настъпва в рамките на 1 час и достига максимум 3 часа след стимулацията. Клетките поддържат повишено ниво на c-fos и c-myc транскрипция в продължение на поне 5 часа. В клетки с инактивиран PCD, стимулирането на c-fos и c-myc от OFC или TFD кристали е значително потиснато, докато индукцията на тези гени от PDGF не се променя.

Членовете на семейството на митоген-активираните протеин кинази (MAP K) са ключови регулатори на различни вътреклетъчни сигнални каскади. Един подклас от това семейство, p42/p44, регулира клетъчната пролиферация чрез механизъм, който включва активиране на протоонкогените c-fos и c-jun. Кристалите OFC и PFKD активират сигнален път на протеин киназата, който включва както p42, така и p44, което предполага роля на този път в индуцираната от калций-съдържащи кристали митогенна митогенеза.

Накрая, индуцираната от OFC митогенеза включва транскрипционния фактор ядрен фактор κB (NF-κB), който за първи път е описан като гена на леката верига на имуноглобулина κ (IgK). Той е индуцируем транскрипционен фактор, важен в много сигнални пътища, тъй като регулира експресията на различни гени. Индукцията на NF-κB обикновено е съчетана с освобождаването на инхибиторни протеини, наречени IκB, от цитоплазмата. Индукцията на NF-κB е последвана от транслокация на активния транскрипционен фактор към ядрото. Кристалите на OFC индуцират NF-κB във фибробласти Balb/c- _3T3 и фибробласти на човешката кожа.

Няколко пътя могат да бъдат включени в сигналната трансдукция след активиране на NF-κB, но всички те включват протеин кинази, които фосфорилират (и по този начин разграждат) IκB. Въз основа на in vitro проучвания, преди се е смятало, че IκB служи като субстрат за кинази (напр. PKC и протеин киназа А). Наскоро обаче е идентифициран IκB киназен комплекс с голямо молекулно тегло. Тези кинази специфично фосфорилират серинови остатъци на IκB. Активирането на NF-κB от TNF-α и IL-1 изисква ефективно действие на NF-κB-индуцираща киназа (NIK) и IκB киназа. Молекулярният механизъм на активирането на NIK понастоящем е неизвестен. Въпреки че OFC кристалите активират както PKC, така и NF-κB, степента, до която тези два процеса могат да бъдат свързани, е неизвестна. Тъй като модификацията на GκB киназата се осъществява чрез фосфорилиране, ролята на PKC в индуцирането на NF-κB от OFC кристалите чрез фосфорилиране и активиране на GκB киназа не може да бъде изключена. Тази концепция се подкрепя от инхибирането на индуцираната от OFC кристали митогенеза и експресията на NF-κB от PKC инхибитора ставроспорин. По подобен начин, ставроспоринът може да инхибира GκB киназата и по този начин да инхибира протеин киназа А и други протеин кинази.

Следователно, механизмът на индуцирана от OFC-кристали митогенеза във фибробластите включва поне два различни процеса:

• бързо мембранно-свързано събитие, което води до активиране на PKC и MAP K, индукция на NF-κB и протоонкогени,
• по-бавно вътреклетъчно разтваряне на кристалите, което води до повишаване на вътреклетъчното съдържание на Ca ²⁺, а след това и до активиране на редица калций-зависими процеси, стимулиращи митогенезата.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Индукция чрез кристали, съдържащи MMP-калций

Медиаторите на тъканното увреждане от калций-съдържащи кристали са MMP - колагеназа-1, стромелизин, 92 kD желатиназа и колагеназа-3.

Като се има предвид връзката между съдържанието на кристали на OFC и разрушаването на ставната тъкан, беше изказана хипотеза, че кристалите на OFC и евентуално някои колагени се фагоцитират от синовиалните клетки. Стимулираните синовоцити пролиферират и секретират протеази. Тази хипотеза беше тествана in vitro чрез добавяне на естествени или синтетични OFC, PFCD и други кристали към култивирани човешки или кучешки синовоцити. Активността на неутралните протеази и колагенази се увеличи дозозависимо и беше приблизително 5-8 пъти по-висока от тази на контролната клетъчна култура, отглеждана без кристали.

В клетки, култивирани в среда, съдържаща кристали, е открита коиндукция на колагеназа-1, стромелизин и желатиназа-92 kDa mRNA, последвана от секреция на ензими в средата.

Кристалите OFC също индуцират натрупването на колагеназа-1 и колагеназа-2 иРНК в зрели свински хондроцити, последвано от секреция на ензимите в средата.

GM McCarty et al. (1998) изследват ролята на вътреклетъчното разтваряне на кристали в кристално-индуцираното производство на MMP. Повишаването на лизозомното pH с бафиломицин А инхибира вътреклетъчното разтваряне на кристали и също така отслабва пролиферативния отговор на човешките фибробласти към OFC кристали, но не инхибира синтеза и секрецията на MMP.

Нито основният калциев фосфат, нито кристалите PFCD индуцираха производството на IL-1 in vitro, но кристалите натриев урат го направиха.

Настоящите данни ясно показват директно стимулиране на производството на MMP от фибробласти и хондроцити при контакт с кристали, съдържащи калций.

Симптомите на остеоартрит показват значителна роля на MMP в прогресията на заболяването. Наличието на калций-съдържащи кристали увеличава дегенерацията на тъканите на засегнатите стави.

Стимулиране на синтеза на простагландини

Наред със стимулирането на клетъчния растеж и секрецията на ензими, калций-съдържащите кристали причиняват освобождаването на простагландини от клетъчни култури на бозайници, особено PGE2 _. Освобождаването на PGE2 _във всички случаи се случва в рамките на първия час след излагане на клетките на кристалите. Р. Ротенберг (1987) определя, че основните източници на арахидонова киселина за синтеза на PGE2 _са фосфатидилхолин и фосфатидилетаноламин, а също така потвърждава, че фосфолипаза А2 _и NOX са доминиращите пътища за _{производство} на PGE2.

PGE1 може да се освободи и в отговор на кристали OFA. GM McCarty et al. (1993, 1994) са изследвали ефектите на PGE2 _, PGE и неговия аналог мизопростол върху митогенния отговор на човешките фибробласти към кристали OFA. И трите агента инхибират митогенния отговор по дозозависим начин, като PGE и мизопростол проявяват по-изразена инхибиторна активност. PGE2 и мизопростол, но не PGE2 _, инхибират натрупването на колагеназна мРНК в отговор на кристали OFA.

М. Г. Маккарти и Х. Чеунг (1994) изследват механизма на OFC-медиираната активация на клетките от PGE. Авторите показват, че PGE, по-мощен индуктор на вътреклетъчен cAMP от PGE2 _и PGE, инхибира OFC-индуцираната митогенеза и производството на MMP чрез cAMP-зависим път на сигнална трансдукция. Възможно е увеличението на производството на PGE, индуцирано от OFC кристалите, да отслаби другите им биологични ефекти (митогенеза и производство на MMP) чрез механизъм на обратна връзка.

Възпаление, предизвикано от кристали

Калций-съдържащи кристали често се откриват в синовиалната течност на пациенти с остеоартроза, но епизодите на остро възпаление с левкоцитоза са редки както при остеоартроза, така и при кристално-асоциирани артропатии (например, синдром на рамото на Милуоки). Флогистичният потенциал на кристалите може да бъде модифициран от редица инхибиторни фактори. R. Terkeltaub et al. (1988) демонстрират способността на кръвния серум и плазмата значително да инхибират отговора на неутрофилните гранулоцити към основни кристали калциев фосфат. Факторите, които причиняват такова инхибиране, са кристал-свързващите протеини. Изследване на един от тези протеини, ₂ -HS гликопротеин (AHSr), показа, че AHSr е най-мощният и специфичен инхибитор на отговора на неутрофилните гранулоцити към OFC кристали. AHSr е серумен протеин с чернодробен произход; Известно е, че в сравнение с други серумни протеини, той се намира в относително високи концентрации в костната и минерализиращата тъкан. Освен това, AHSr присъства в „невъзпалена“ синовиална течност и е открит и върху основни кристали калциев фосфат в нативна синовиална течност. Следователно, възможността AHSr да модулира флогогенния потенциал на основните кристали на калциев фосфат in vivo не може да бъде изключена.

За да обобщим всичко по-горе, представяме две схеми на патогенеза на остеоартрит, предложени от WB van den Berg et al. (1999) и M. Carrabba et al. (1996), които съчетават механични, генетични и биохимични фактори.