Ембрионални стволови клетки

Откриването на ембрионални стволови клетки не е възникнало случайно, а се е появило на подготвената почва на научни изследвания в областта на биологията на развитието. Терминът „стволова клетка“ е въведен в медицината през 1908 г. на конгреса на хематологичното дружество в Берлин от Александър Максимов във връзка с хематопоетичните клетки. Много преди изолирането и производството на стабилни линии от плурипотентни ембрионални стволови клетки, стволовите терато-(ембрио-карциномни) клетки са били използвани в изследвания на ранните процеси на развитие, с помощта на които са били изучавани неизвестни механизми на ембриогенезата, включително последователността на експресия на ранни гени и протеинови продукти от тяхната активност.

Но дали тотипотентността на човешкия геном е безвъзвратно загубена в процеса на еволюцията? Не, и ембриогенезата е доказателство за това. Ако това е така, тогава кога по принцип ще се осъществи вторият път на еволюционно развитие? Вероятно, когато човек навлезе в космоса, където условията на околната среда ще бъдат относително постоянни за достатъчно дълго време. Загубата на костна тъкан (деминерализация на костите в състояние на безтегловност), която много бавно подлежи на ремоделиране и регенерация, може да се счита за първата стъпка в процеса на адаптация на човека, като вид, към съществуване в космически условия. Цената за втория път на еволюционно развитие обаче ще бъде различна - цената за връщане на тотипотентността и абсолютната пластичност на всички клетки ще бъде стерилността. Така че, в този свят на „еволюционни хамелеони“, ще трябва да се размножаваме без мейоза, чрез пъпкуване. Но ще живеем дълго. Теломеразното безсмъртие е безсмъртието на амебата. В многоклетъчния организъм стволовите клетки са субстрат на количественото и качественото дълголетие.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Източници на ембрионални стволови клетки

Днес източниците на ембрионални стволови клетки за лабораторни изследвания са линии на миши тератокарцином (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) и човешки тератокарцином (NTERA-2, TERA-2, H-9 клон), както и ESC линии на Trauneon. Наличието на подробен клетъчен паспорт, указващ имунния фенотип, резултатите от хромозомния анализ, профилите на експресия на мРНК, експонираните рецептори и вътреклетъчните сигнални протеини, обаче не компенсира съществените недостатъци на ESC линиите на тератокарцином - бърза загуба на тотипотентност и невъзможност за използването им в клинични изпитвания, докато смесената диференциация в култура прави много трудно изолирането на чиста специализирана линия от хетерогенна клетъчна популация. Следователно, източникът на ESC линии, създадени за клинични цели, обикновено е вътрешната клетъчна маса на бластоцистата, отделни бластомери на ембриони в 8-клетъчен стадий, морулови клетки от по-късни стадии, както и първични зародишни клетки.

Трябва да се отбележи, че тератокарциномните клетки, въпреки че притежават свойството на плурипотентност, се характеризират със значително по-нисък плурипотентен потенциал в сравнение с ембрионалните стволови клетки (ESC). Интеграцията им с ембрионални клетки рядко води до образуването на химери, които освен това никога не образуват гамети с генотипа на тератокарциномните клетки. Смята се, че това се дължи на честата поява на хромозомни аномалии по време на култивирането на тератокарциномни клетки: загуба на Y хромозомата, различни тризомии, делеции или транслокации.

Опити за изолиране на човешка ембрионална ембрионална линия (ЕМК) са правени многократно, но тази задача не е решена, тъй като нормалните човешки бластоцисти са труднодостъпни. Освен това, честотата на хромозомните аномалии при хората е по-висока, отколкото при ембриогенезата при животните. По-голямата част от ранните човешки ембриони, получени след ин витро оплождане, показват хаотичен хромозомен мозаицизъм и често имат числени и структурни аберации. Дори по-късно, на етап бластоциста, само 20-25% от човешките ембриони се състоят от клетки с нормален кариотип. Беше практически невъзможно да се използват такива ембриони за създаване на ЕМК, тъй като зиготите обикновено се култивират до етап с два или четири бластомера и след това се трансплантират в матката. Едва сравнително наскоро беше разработена надеждна техника за култивиране на оплодени човешки яйцеклетки до етап бластоциста. Въвеждането на тази техника в практиката на ин витро оплождането не само увеличи честотата на успешните имплантации, но и направи нормалните бластоцисти по-достъпен обект.

Друг източник на плурипотентни стволови клетки са първичните зародишни клетки, които за разлика от по-напредналите прогениторни популации на зародишния епител, нямат бета-интегрин на повърхността си, но експресират висока активност на алкална фосфатаза. Трябва да се отбележи, че популации от стволови клетки, образувани от първични зародишни клетки, се изследват експериментално от 80-те години на миналия век. По това време е разработена техника за изолиране на първични зародишни клетки от рудимента на гонадата на мишия ембрион. Първите неуспешни резултати от култивирането на първични зародишни клетки in vitro предполагат безполезността на тези опити, тъй като клетките, въпреки че оцеляват, не пролиферират и умират в рамките на първия ден. По-късно е установено, че миши първични зародишни клетки се размножават in vitro само в присъствието на разтворими и мембранно свързани специфични полипептидни растежни фактори в културалната среда. Резултатите от многобройни изследвания показват, че за оцеляването и пролиферацията на първичните зародишни клетки е необходимо наличието не само на LIF, но и на мембранно свързани и разтворими Steel фактори (SIF) в културалната среда. Тези пептиди се произвеждат от соматични клетки на ембриони, хомозиготни за Steel мутацията, и един от тях е лиганд на cKit протоонкогена.

Първичните зародишни клетки на бозайници и хора имат екстрагонаден произход и са източник на клонално развитие на клетъчната линия на зародишните клетки. Произходът на първичната зародишна клетъчна линия, както и на всички ембрионални тъкани и екстраембрионния мезодерм, е епибластът (първичен ектодерм) на ранните ембриони, който има мозаична структурна организация. Чрез метода на микрохирургично отстраняване на различни части от ранния ембрион е установена зона на локализация в епибласта на клона на ангажирани прекурсори на първични зародишни клетки. С помощта на родамин декстран, който е използван като клетъчен маркер, е установено, че прекурсорите на първичните зародишни клетки са локализирани в проксималната област на епибласта, близо до екстраембрионния ектодерм. Първичната зародишна клетъчна линия произлиза от 45-клетъчен клон, чието разпределение се случва в самото начало на гаструлацията. След това клонът се сегрегира и по време на гаструлацията първичните зародишни клетки навлизат в екстраембрионния мезодерм и се намират в основата на алантоисния рудимент, зад първичната жилка. Оттам първичните зародишни клетки мигрират към вентралната част на ендодермата на задното черво и след това активно се движат по мезентериума, заселвайки гениталните гребени в края на миграцията. По време на миграцията, както и през първите 2-3 дни от локализацията в гонадния рудимент, първичните зародишни клетки активно пролиферират и преминават през осем репликативни цикъла. Ако в началото на миграцията има около 50 първични зародишни клетки, то в гениталните гребени на миши ембриони с дванадесетдневно развитие броят на първичните зародишни клетки надвишава 25 000.

Функционалното сходство на ембрионалните стволови клетки (ESC) и първичните зародишни клетки се доказва от пълната интеграция на последните в бластоцистата със заместване на вътрешната клетъчна маса и последващо пълноценно развитие на ембриона, чиито тъкани се състоят само от потомците на първичните зародишни клетки. По други свойства, първичните зародишни клетки на мишките също се оказаха идентични с ESC, демонстрирайки способността да се диференцират в различни посоки, да образуват ембриоидни тела in vitro и да образуват тератоми in vivo при подкожно приложение на имунодефицитни мишки, наподобявайки спонтанни тестикуларни тератоми при 129/ter мишки.

Установено е, че когато към средата се добавят LIF, мембранно-свързан и разтворим SIF, изолираните първични зародишни клетки на 8-дневни миши ембриони оцеляват и се размножават в културата в продължение на 4 дни, но след това умират. Освен това, периодът, в който се наблюдава смъртта на първичните зародишни клетки в културата, съвпада с етапа на развитие на мишите ембриони (12,5-13,5 дни), когато женските първични зародишни клетки навлизат в мейоза в зачатъците на гонадите, а митотичните деления са блокирани в мъжките първични зародишни клетки. Ако обаче към средата се добавят не само растежните фактори LIF и SIF, но и FGF2, първичните зародишни клетки продължават да се размножават и в субкултурите се образуват колонии от клетки, способни да се размножават дори след отстраняването на растежните фактори (SIF и FGF) от средата. Такива клетки могат да се култивират дълго време върху субстрат от ембрионални фибробласти, без да се добавя разтворимият растежен фактор LIF. Предложено е тези стабилни клетъчни линии, получени от първични зародишни клетки, да се наричат ембрионални зародишни клетки. Този термин изобщо не е успешен, тъй като е невъзможно да се получат ембрионални зародишни клетки, способни да извършват последващи етапи на оогенеза или сперматогенеза, при култивиране на EG клетки. Това се дължи на факта, че EG клетъчните линии, въпреки че произхождат от първични зародишни клетки, но придобивайки свойствата на ембрионални плурипотентни стволови клетки в културата, губят способността си да се свързват с зародишни линии. С други думи, първичните зародишни клетки, когато се култивират, губят свойствата на гаметни прекурсори и се трансформират в ESC-подобни плурипотентни клетки.

Беше отбелязано, че тератомите не възникват, когато EG клетки се въвеждат в имунодефицитни мишки. Предполага се, че загубата на способността на човешките EG клетки да пораждат тератоми се дължи на факта, че тези линии не са създадени директно от култивирани първични зародишни клетки, а са получени от клетки, изолирани от ембриоидни тела. Следователно е възможно те да са потомци на плурипотентни, но вече ангажирани клетки.

Трябва да се отбележи, че съществуват фундаментални разлики между EG клетките и първичните зародишни клетки. Последните не позволяват получаването на химерни миши ембриони, което показва липсата на способност на първичните зародишни клетки да се интегрират във вътрешната клетъчна маса или трофектодермата. Характеристиките на популацията на първичните зародишни клетки са по-близки до ангажираните линии от соматични клетки на по-късни ембриони, чието въвеждане в бластоцистата също не води до образуване на химерни ембриони.

Модификацията на техниката на култивиране на ембриоидни тела, получени чрез агрегация на EG клетки, позволи получаването на друга популация от плурипотентни клетки, наречени „клетки, получени от ембриоидни тела“ (EBD клетки), чрез селекция върху селективни среди. Способността на EBD клетките да пролиферират в култура за дълго време направи възможно създаването на стабилни клетъчни линии от ангажирани клетки. Получени бяха клонинги на клетки, експресиращи широк спектър от mRNA и протеинови маркери на специализирани клетки. Този подход в крайна сметка доказа, че човешките първични зародишни клетки са плурипотентни и се диференцират in vitro в различни клетъчни типове: неврони, невроглия, съдов ендотел, хематопоетични клетки, мускулни и ендодермални клетки.

Алтернативни източници на ембрионални стволови клетки

Алтернативен източник на човешки ESC линии могат да бъдат хибридните клетки. Имплантирането в матката на псевдобременни крави на хетерогенна конструкция, получена чрез сливане чрез електропорация на соматични клетки на човешкия плод с кравешка яйцеклетка, от която предварително е отстранен пронуклеусът, позволява получаването на вътрешна клетъчна маса от изкуствен ембрион на преимплантационни етапи на развитие. За тази цел на първия етап се получава бластоциста от кравешка яйцеклетка с трансплантирано ядро на човешка клетка.

На втория етап от бластоцистата се изолира ембриобласт, а от него се изолират ембрионални стволови клетки (ESC), използвайки метода на Томсън. Прави впечатление, че най-добрите резултати при изолиране на ESC линии, използвайки този метод, са получени при използване на ядра на фоликуларни клетки или първични зародишни клетки, които остават в човешкото тяло в състояние на хибернация. Това се дължи на факта, че ядрата на човешки клетки, трансплантирани в краве яйце, трябва да имат несъкратени теломери и висока теломеазна активност, което помага да се избегне преждевременното стареене на ESC клонинги, получени от хибридно яйце (Repin, 2001). Известно е, че най-важните вътреклетъчни маркерни протеини на ESC са Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, които принадлежат към така наречените хроматинови заглушителни протеини. Заглушителите осигуряват особено компактна опаковка на хетерохроматин, което предотвратява образуването на еухроматинови бримки. Опаковката на хроматин, медиирана от тези протеини, корелира с тотипотентността на ESC генома. Към днешна дата е установено, че зрелите говежди и човешки ооцити са единственият вид специализирани клетки, които съдържат високи концентрации на заглушаващи протеини в цитоплазмата. На тази основа е разработен метод за получаване на хибридни ембрионални стволови клетки (ESC) чрез прехвърляне на соматични клетъчни ядра в енуклеирани говежди ооцити. Предварителни in vitro проучвания показват, че цитоплазмата на говеждите ооцити възстановява тотипотентността на генома на човешките соматични клетъчни ядра след 12-24 часа култивиране.

Особен интерес представляват данните за особеностите на преимплантационното развитие на човешките ембриони, показващи по-късно заместване на тотипотентните клетки от популация от плурипотентни клетки, отколкото при мишките. Проучване на клетъчни трансформации показа, че трофобластните клетки също възникват от клетките на вътрешната клетъчна маса на човешките бластоцисти, в допълнение към ембрионалните стволови клетки (ESC), което показва тяхната обща потентност.

Известно е, че на етапа на бластоциста възникват две различно ангажирани клетъчни популации. Едната от тях образува външния слой на бластоциста - трофектодермата, чиито производни са трофобластните клетки и други ембрионални компоненти на плацентата. Втората популация от клетки е групирана в плътна маса, контактуваща с вътрешната повърхност на трофектодерма. Производните на популацията от клетки на вътрешната клетъчна маса са всички тъкани и рудименти на органите на ембриона. На етапа на късната бластоциста от вътрешната клетъчна маса се образува екстраембрионният ендодерм и се образува епибластът (първичен ектодерм). В този случай епибластните клетки запазват плурипотентност, докато способността за диференциация на клетките на екстраембрионния ендодерм е ограничена.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Получаване на човешки ембрионални стволови клетки

Доскоро се смяташе, че е невъзможно да се получат ембрионални стволови клетки (ESC) от трофобласт. Въпреки това, линия от диплоидни трофектодермални стволови клетки, изолирани от бластоциста, пролиферира и се трансформира в стволови клетки в среда, съдържаща FGF2 и хепарин вместо LIF. Ако FGF2 се отстрани от средата, трофектодермалните клетки спират да се размножават, в тях започва хромозомна ендоредупликация и клетъчните елементи на трофектодермата постепенно се трансформират в гигантски трофобластни клетки. Вероятно LIF не стимулира пролиферацията на трофектодермалните клетки поради факта, че FGF2 задейства различен транс-сигнален механизъм, тъй като FGF2, свързвайки се с плазмения рецептор (FGFR2), активира MAP киназите в цитоплазмата - ERK1 и ERK2. Следователно, когато един сигнален път (LIF - gpl30 - JAK киназа - STAT3) е включен в клетките на бластоцистата, клетките от вътрешната клетъчна маса се трансформират в плурипотентни ембрионални стволови клетки (ESC), а когато вторият механизъм на трансмембранна сигнална трансдукция (FGF2 - FGFR2 - MAP киназа ERK1/ERK2) е активиран, в бластоцистата се образуват трофектодермални стволови клетки. Изборът на сигналния път, от своя страна, зависи от активността на гена oct4. Този ген, който принадлежи към POU домейна, е локализиран в t-локуса на автозома 17 и се експресира по време на оогенезата, по време на периода на разцепване, както и в клетките от вътрешната клетъчна маса на бластоцистата и в първичните зародишни клетки. Функционалната роля на гена oct4 е да кодира транскрипционен фактор, необходим за появата на плурипотентни клетки, тяхната диференциация и дедиференциация.

Експресията на гена oct4 в ембрионалните стволови клетки (ESC) варира в зависимост от взаимодействието на този транскрипционен фактор с кофакторите. Насочената регулация на експресията на oct4 в бластоцистите показа, че когато активността му е намалена, половината от клетките образуват трофектодерм, докато когато индуцираната експресия на oct4 се увеличи, възникват предимно ESC.

В експеримента, ембрионалните стволови клетки (ESC) не могат да бъдат прехвърлени в линия по време на култивирането на тотипотентни бластомери на етапа на разцепване, както и на етапа на гаструлация и по-късните етапи на ембрионалното развитие. Миши ESC обикновено се изолират на 3,5-4,5-ия ден от бременността, което съответства на шестия (еднослойна бластоциста) и седмия етап (двуслойна бластоциста - ранен яйчен цилиндър) на нормалната ембриогенеза. Очевидно е, че само в преимплантационния период мишите ембриони съдържат клетъчни популации, способни да се трансформират в ESC. Следователно, изолирането на ESC линии е възможно само на определени етапи от ембриогенезата. Зиготата и бластомерите, възникващи по време на разцепването, са тотипотентни от гледна точка на възможността за развитие на жизнеспособен ембрион с ембрионални мембрани и плацента. Загубата на обща потентност на зародишните клетки започва в късния етап на морулата, когато по-нататъшното ангажиране на бластомерите зависи от тяхното местоположение. Ранните бластомери на морулата запазват тотипотентност, тъй като експерименталните манипулации с промените в тяхната локализация, като например инверсия на местоположението им, не пречат на развитието на пълноценен ембрион.

Установено е, че ефективността на изолирането на ембрионални стволови клетъчни стволови клетки (ESC) в линия се влияе от състоянието на бластоцистите по време на тяхната експлантация. Използването на бластоцисти след моделиране на седемдневна диапауза в репродуктивния тракт на мишки, овариектомирани на 3,5-ия ден от бременността и на които е даден прогестерон, улеснява по-успешното изолиране на ембрионални стволови клетъчни линии. Предполага се, че при такива условия броят на бластомерите, образуващи вътрешната клетъчна маса, се увеличава. Възможно е също клетъчният цикъл да се удължи и повечето бластомери да навлязат в G0 фазата.

Освен това, създаването на стабилни плурипотентни ESC линии зависи от генотипа на ембрионите: ESC се изолират сравнително лесно от бластоцисти на линията 129 на мишките, те са много по-трудни за получаване с помощта на мишки CS7BL/6 и е практически невъзможно да се изолира ESC линия от бластоцисти на CBA/Ca мишки. Очевидно е, че ранните ембриони имат някои генетични характеристики, които влияят върху развитието на плурипотентна ESC линия. Въпреки това, при култивиране на изолирани епибласти, както и чрез селективна селекция на диференциращи се клетки, ESC линии все пак бяха изолирани от ранни ембриони на CBA/Ca мишки.

Доказана стандартна техника за получаване на ESC линии от бластоцисти е дадена в лабораторни ръководства за техниката на експерименти с ранни ембриони. Експериментални ESC линии могат да бъдат получени и чрез култивиране на изолиран епибласт (първичен ектодерм) на 4,5-дневни миши ембриони, използвайки доста сложна микрохирургична техника и модифицирани условия на култивиране. Трудоемкостта на тази процедура е оправдана, тъй като честотата на образуване на ESC линии в този случай се оказа значително по-висока, отколкото при работа с вътрешната клетъчна маса на бластоцистата.

За изолиране на ESC линии, всеки клон се прехвърля в микроямка, отглежда се агрегат от 40-60 клетки и след това се диспергират отново. Многократните повторения на тази процедура ни позволяват да получим имортализирана ESC линия с максимална скорост на пролиферация на нормокариотипни клетки, прикрепени към пластмаса, които запазват тотипотентност и висока теломеразна активност след 50-100 пасажа. В процеса на поддържане на ESC линии най-голямата опасност е замърсяването на средата или серума с бактериални ендотоксини - дори следови концентрации на ендотоксин в хранителната среда причиняват масова смърт на незрели зародишни клетки. При внимателно наблюдение на линейния растеж и навременно диспергиране, ESC в културата са способни на симетрично делене, при което и двете дъщерни клетки остават плурипотентни и способни да извършват неограничен брой клетъчни цикли, поддържайки диплоиден кариотип и обща потентност.

Селекцията на чиста популация от човешки ембрионални стволови клетки (ESC) може да се извърши след трансфекция на техния геном с рекомбинантни ДНК молекули, съдържащи гена, кодиращ синтеза на зелен флуоресцентен протеин (GFP). Експресията на GFP се увеличава, когато ESC се отглеждат при условия, които подпомагат тяхната пролиферация, докато с началото на диференциацията нивото на експресия на този ген намалява, което позволява селекция на чисти стабилни плурипотентни клетъчни линии върху селективна среда. При култивиране на ESC, изолирани с помощта на GFP селекция, честотата на образуване на колонии се увеличава многократно, тъй като мощният антипролиферативен ефект на диференцираните клетки се елиминира при условията на селекционни култури.

Транслацията на човешки ембрионални стволови клетки в линия се извършва чрез метода на тяхното изолиране от преимплантационни ембриони (на етап 80-120 клетки), които остават след процедурата за ин витро оплождане. За тази цел изкуствено получените „излишни“ ембриони се диспергират механично в среда на Делбеко-Ийгъл. След маркиране на клетките със селективни моноклонални антитела с флуоресцентен маркер, ембриобластните клетки се изолират. Ембриобластът се диспергира в отделни клетки с помощта на диспазно-колагеназна смес. Дисоциираните клетки се отглеждат в специална среда (80% среда на Делбеко + 20% фетален телешки серум в присъствието на 500 μg/ml IL-6, LIF и SCF) върху захранващ монослой от ембрионални фибробласти от първите 3 пасажа. В този случай оцеляването и пролиферацията на стволови и прогениторни клетки се поддържат благодарение на ефекта на IL-6, LIF и SCF. В такава среда, ембрионалните стволови клетки (ESC) растат като суспензионни клонове от неприкрепени, сгъстени клетки, които трябва да бъдат дисоциирани чрез меко, многократно пипетиране. Нови клонове се появяват в суспендираната култура на 5-7-ия ден. Максималната скорост на растеж на ESC се постига чрез многократна дисоциация на клонове на етап 10-15 клетки. След това всеки клон се прехвърля в микроямка и се култивира до агрегат от 40-50 клетки. Процедурата се повтаря многократно в пасажи, увеличавайки обема на културата до плътност от 5-10 милиона клетки на 6-сантиметрова плака. Използвайки такова пасажиране, Томсън изолира 10 безсмъртни клона на човешки ESC, които след 100 пасажа запазват висока теломеразна активност, способност за енергична пролиферация, минимални фенотипни характеристики и обща ефикасност със способността да се диференцират във всяка от 350 специализирани клетъчни линии, получени от екто-, мезо- и ендодерма. Диференциацията на човешките ембрионални стволови клетки (ESC) започва (след смяна на средата, добавяне на серум и елиминиране на LIF) с прикрепване на клетките към субстрата, което показва развитието на цитоскелета и експресията на адхезионни рецептори. Важно е, че с неограничена пролиферация, човешките ембрионални стволови клетки запазват нормален кариотип.

Вторият метод за изолиране на човешки ESC линии се основава на използването на първични зародишни клетки. Експериментални изследвания показват, че E клетъчни линии могат да бъдат получени от гениталните гънки на 12,5-дневни миши ембриони. В тези случаи обаче честотата на образуване на прогениторни клетъчни линии е значително по-ниска, отколкото в експерименти с по-ранни ембриони. В същото време, първичните зародишни клетки от гонадите на миши ембриони на 13,5-дневна гестационна възраст изобщо не са способни да се трансформират в линии.

Първите стабилни линии от плурипотентни човешки EG клетки са получени от първични гоноцити, изолирани от гонадите на 5-9-седмични ембриони. Изолираните клетки са култивирани върху субстрат от инактивирани миши ембрионални фибробласти в DMEM среда с фетален серум, допълнен с меркаптоетанол, форсколин и рекомбинантни човешки растежни фактори (FGF и LIF). След 7-12 дни в културата се появяват многоклетъчни колонии, съответстващи на човешки EG клетки по морфологични характеристики и молекулярни маркери. След агрегация тези клетки образуват ембриоидни телца, с по-нататъшното развитие на които се появяват специализирани клетки, характерни за производни и на трите зародишни слоя. В течение на 10-20 пасажа EG клетъчните линии запазват нормален кариотип и не губят плурипотентност.

Доказано е също, че комбинираното действие на LIF, мембранно-свързани и разтворими Steel фактори и TGF-b променя програмата за развитие на първичните зародишни клетки. Вместо да прекратят митотичните деления и да започнат да се диференцират към оогенеза или сперматогенеза, първичните зародишни клетки продължават да пролиферират. След няколко допълнителни митотични цикъла, те стават подобни на епибластните клетки и, губейки свойствата на прекурсорите на зародишните клетки, се трансформират в плурипотентни ембрионални стволови EG клетки.

Така, през 1998 г., за първи път от гениталния рудимент на тъкан от аутопсия на човешки фетус са изолирани иммортализираните линии от първични зародишни клетки. В човешката ембриогенеза, първичните зародишни клетки се появяват в жълтъчния сак през 3-тата седмица от развитието, а през 4-5-тата седмица тези клетки мигрират към зоната на гениталния туберкул, където образуват латентни популации от първични гоноцити. В неактивно състояние, първичните зародишни клетки се запазват в ембриона до раждането. Линии от първични зародишни клетки се изолират от феталния гениталния туберкул на 5-9-седмични ембриони, чиято извлечена тъкан се третира ex tempore със смес от колагенази типове IV-V, хиалуронидаза и ДНКаза, за да се увеличи количественият и качественият добив на клетки. Първичните зародишни клетки в тъканта на феталния гениталния туберкул са заобиколени от стромални (мезенхимни) Сертолиеви клетки. Функционалната цел на Сертолиевите клетки е да произвеждат антиапоптотични фактори (Fas лиганд), митогени и имуносупресори, които защитават зародишните клетки от имунна атака от страна на организма. Освен това, стромалната микросреда на гениталния туберкул играе важна роля в узряването на гаметите. Изолираните първични зародишни клетки се засаждат в култура върху захранващ стромален слой, състоящ се от фетални фибробласти от първите три пасажа. Най-ефективната комбинация от митогени е комплекс, състоящ се от LIF, FGF и форсколин (стимулатор на образуването на cAMP). Пролиферацията на първични зародишни клетки in vitro изисква добавяне на фетален серум, в чието присъствие размножаването на първични гоноцити в културата е съпроводено с образуването на клонове от сферични клетки, неприкрепени към субстрата.

В Националните здравни институти на САЩ, въз основа на обобщение на съществуващите данни за методите за изолиране на човешки ембрионални стволови клетки (ЕСК) от бластоцисти, е направено предварително заключение, че успешното изолиране на ЕСК е най-вероятно при култивиране на бластоцисти с добре оформена вътрешна клетъчна маса (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). От тази гледна точка, оптималният източник на ЕСК за създаване на линии са човешките бластоцисти на 5-ия ден от развитието, от които трофектодермата трябва внимателно да се отстрани при изолиране на вътрешната клетъчна маса. Изолираната вътрешна клетъчна маса, състояща се от 30-35 клетки на този етап, трябва да се култивира върху субстрат от ембрионални миши фибробласти, което е решаващо условие за образуването на ЕСК колонии в културата.

Анализ на фенотипните характеристики на ембрионалните стволови клетки

От особен интерес е междувидовият сравнителен анализ на фенотипните характеристики на ембрионалните стволови клетки (ESC). Установено е, че човешките ESC колонии са плътни клъстери от сплескани, епителни клетки, докато мишите ембриоидни тела се състоят от рохкав конгломерат от заоблени клетки. В човешките ESC индексът на ядрено-плазмено съотношение е по-нисък, отколкото в мишите ESC. Ембрионалните стволови клетки на маймуни образуват по-плоски колонии от клетки с неравни ръбове. Отделните клетки са лесно видими в ранните клонове на ESC на примати. Пролифериращите ESC от всички изследвани животински видове не експресират MHC клас I и II молекули. В същото време, човешките ESC дават положителна реакция към TERA 1-60 и GCTM-2 антитела, което показва наличието на кератин/хондроитин сулфат протеогликани на тяхната повърхност, характерни за ембрио-(терато)-карциномните стволови клетки. Експресията на гена oct4 в ESC от всички животински видове предполага, че въпреки фенотипните разлики, един и същ набор от гени, отговорни за поддържането на плурипотентност, очевидно е активиран в човешки и миши ESC (Peru, 2001). Освен това, ESC линиите, изолирани от ембриони на плъхове, свине, зайци, примати и говеда, имат сходни морфологични характеристики, подобен набор от молекулярни идентификационни маркери и почти идентичен молекулярен механизъм за прилагане на програми за ембриогенеза, което ни позволява да погледнем по нов начин върху проблема с ксенотрансплантацията.

За разлика от нормалната ембриогенеза in vivo, пролиферацията на ембрионални стволови клетки (ESC) in vitro не е съпроводена с образуването на зародишни слоеве и протича на фона на блокиране на хомеотичните Hox-гени, т.е. без органогенеза. Тъй като сегментационните гени не функционират, е невъзможно да се възпроизведат такива периоди на ембриогенеза като полагане на сомити, сегментация на ембриона, образуване на жълтъчния сак, алантоиса и други провизорни органи и тъкани в ESC култура. Култивираните ESC сякаш са замръзнали в началото на процеса на образуване на 350 рестрикционни линии от специализирани клетки. По този начин, клонинг на дъщерни прогениторни клетки и централно локализирана ESC представляват само модел на ембрион, по време на чието развитие едновременно се формират различни линии от специализирани клетки в различни тъканни области, които обаче произхождат от общи прекурсори. Въпреки минималното ниво на рецептори на повърхността на ESC, те запазват способността си да осъществяват примитивни морфогенетични процеси, имитиращи обемните структури на ранен ембрион: суспензия от ESC в културата се агрегира и образува структури, наподобяващи бластоцисти или дори по-късни ембриони (яйчени цилиндри). Такива суспензионни агрегати се наричат съответно прости и сложни ембриоидни тела.

При смесена диференциация, ранните гени на ектодермата (oct3, fgf-5, nodal), ендодермата (gata-4), мезодермата (brachyury), кардиогенния мезодерм (pkh-2.5), невралната тръба (msx3) и хематопоезата (elkf) се експресират едновременно в различни клетки на едно ембриоидно тяло. Използвайки различни комбинации от растежни фактори и цитокини за целенасочено действие върху образуването на клетки от зародишен слой in vitro, в редица случаи беше възможно да се получат ембриоидни тела, в които преференциално се експресират гени на ектодермата или мезодермата, което отваря пътя към моделиране на гаструлацията и началните фази на органогенезата.

Клоновият растеж на ембрионалните клетки (ESC) е доказателство за асиметрично клетъчно делене, при което само една ESC в центъра на клона запазва неограничен потенциал за пролиферация, докато втората дъщерна клетка генерира поколение прогениторни клетки, които вече са в процес на диференциация. Следователно, скоростта на пролиферация на клона в периферията на ембриоидното тяло е по-висока, отколкото в центъра. Маргиналните клетки на растящия клон претърпяват спонтанна нарушена диференциация, мигрират или умират чрез апоптотични механизми. Тези събития определят съдбата на клона: ако скоростта на пролиферация надвишава скоростта на миграция и апоптотична клетъчна смърт, клонът продължава да се увеличава по размер, стабилизация настъпва, когато скоростта на апоптоза и скоростта на образуване на нови клетки са равни, а регресия настъпва, когато съотношението на тези процеси е обратно. Прогениторните клетки се делят симетрично, т.е. и двете дъщерни клетки впоследствие се диференцират в зрели специализирани клетъчни линии. Съотношението на ESC към прогениторните клетки варира, но броят на ESC винаги е само част от процента от популацията на прогениторните клетки. Следователно, само внимателното пипетиране и навременното дезагрегиране на клоновете може да увеличи броя на ESC в културата. Дезагрегацията на клонинги на етап 10-12 клетки се оказа най-ефективна за получаване на максимален добив на ембрионални стволови клетки (ESC). Посоката и степента на диференциация на клетките в ембриоидното тяло зависят от тяхното местоположение. Външните клетки на ембриоидното тяло не експресират гена oct4 и претърпяват диференциация в клетки на първичния ендодерм, от които впоследствие се образуват епителноподобни клетки на париеталния и висцералния екстраембрионен ендодерм. Вътрешните клетки на ембриоидното тяло експресират гена oct4 и запазват плурипотентност в продължение на 48 часа култивиране. След това обаче културата се преструктурира морфологично в епителен монослой и започва експресията на гени, контролиращи развитието на първичния ектодерм. След това започва процесът на тотална нарушена цитодиференциация с появата на различни клетъчни типове, които са производни на трите зародишни слоя. В процеса на спонтанна диференциация на клетките на ембриоидното тяло, първите се появяват агрегати с ендодермни маркери под формата на фрагменти (кисти) на жълтъчния сак. След това в тези структури се появяват ангиобласти и ендотелни клетки на растящите капиляри. В крайните етапи на спонтанната диференциация от вътрешните клетки на ембриоидното тяло се развиват различни терминално диференцирани клетки, включително неврони, глиални елементи, кардиомиоцити, макрофаги и еритроцити. До известна степен (като се вземе предвид пространствената инверсия на образуването на слоевете зародишна тъкан), използвайки ембриоидни тела, е възможно да се изучават морфогенетичните процеси in vitro и да се анализират молекулярните механизми на началните периоди на ембрионална цитодиференциация.както и да се установи ролята на специфични гени в осъществяването на тези процеси.

По този начин, в рамките на клона има клетки, в които са открити различни програми за генетично развитие - ембрионални стволови клетки (ESC), ранни прогенитори и диференциращи се прогениторни популации. Култивирането на ESC чрез методите на висяща капка или масова култура без захранващ слой и без добавяне на LIF към средата неизбежно води до образуването на ембриоидни тела. Морфологията на клетките на външния и вътрешния слой на ембриоидните тела се различава. Външният слой се състои от големи, разклонени клетки. Повърхността им, обърната към околната среда, е покрита с множество микроворси. Външният слой на клетките е отделен от вътрешния слой с базална мембрана, наподобяваща мембраната на Райхерт, докато клетките на вътрешния слой на ембриоидните тела са цилиндричен епител. Морфологично вътрешният слой, въпреки че съдържа много делящи се клетки, наподобява повече недиференцирани колонии от ESC.

Характеристики на човешките ембрионални стволови клетки

Липсата на паренхимно-мезенхимни сигнални взаимодействия на фона на блокиране на гените за хомеоза води до нарушен растеж на ембрионалните стволови клетки (ESC) в култура, тъй като това нарушава формирането и развитието на инфраструктурата на провизорните органи. Неорганизираният растеж и нарушената спонтанна диференциация на ESC в култура се дължат на липсата на мезенхимно маркиране на стромалната рамка на бъдещите органи: in vitro е напълно възможно да се образуват милиони хепатоцити, но е невъзможно да се получи един-единствен чернодробен лобул, който да включва такива структурни и функционални елементи като синуси, Дисеови пространства и Купферови клетки.

Смята се, че плурипотентността на ембрионалните клетки (ESC) се реализира изключително в ембриогенезата с образуването на тъкани и органи на ембриона, докато плацентата и пъпната връв са производни на трофобласта. ESC, затворени в трофектодермалната мембрана, последователно генерират клонове на провизорни клетки, които реализират програмата за развитие чрез комбинаторната иРНК на обемната топографска матрица на Нохтейов, които предопределят пространственото разположение, формата и размера, броя на клетките на провизорните и дефинитивните органи, както и сглобяването на паренхима в структурни и функционални единици. В същото време ESC остават единственият вид клетки, при които молекулярният механизъм за реализиране на техните потенции е напълно несвързан с генетичната програма за развитие, а самите ESC са лишени от способността да взаимодействат с други клетки поради блокирането както на рецепторните възприятия, така и на транссигналните системи. Адекватното активиране на ESC обаче води до поетапно развитие на програмата за ембриогенеза, завършващо с раждането на напълно оформен организъм, състоящ се от милиарди клетки, готов за извънматочен живот. По този краткосрочен, но невъобразимо дългосрочен път в клетъчното пространство неизбежно възникват грешки както в молекулярните механизми, осигуряващи жизнената активност на клетките, така и в програмите, контролиращи тяхната пролиферация, диференциация и специализация. Следователно, в съвременната фармакогеномика заболяванията на молекулярната структура и заболяванията на клетъчното програмиране се разглеждат отделно. Нещо повече, действието на повечето нови лекарства е насочено към коригиране на програмите на диференциация, пролиферация и органогенеза, както и към регенерация на органи и тъкани. В един възрастен организъм, ембрионалните стволови клетки (ESC) позволяват да се контролира поведението на стволови/прогениторни клетки, трансплантирани в мозъка, черния дроб, далака, костния мозък и други човешки органи, за да се възстанови увреденият паренхим на органите на реципиента чрез диференциране и специализиране на донорските клетки върху запазената мезенхимна матрица. По същество програмата за тотипотентност започва да се реализира на ниво геноми на ооцитите, зиготите и бластомерите; тези клетки обаче все още не са клонирани и пасирани в количества, необходими за нуждите на експерименталната и практическата медицина. Следователно, ембрионалните клетъчни клетки (ESC) остават уникален източник на генетична информация, съдържащ кодове за триизмерна карта на ембриона и кодове за линейно ограничаване на специализирани клетъчни линии по време на гаструлация.

Практически неограниченият регенеративен потенциал на ембрионалните стволови клетки (ESC) се дължи на факта, че техният геном, за разлика от генетичния апарат на диференцираните соматични клетки, запазва плурипотентност. Една от проявите на латентното състояние на генетичната информация, вградена в ESC, е т. нар. минимален фенотип - ограничен брой рецептори се експресират на повърхността на ESC и съответно много малко транс-сигнални програми са разгърнати за взаимодействието на ядрения апарат на клетката с нейната микросреда. На фона на хибернация на гени, отговорни за ограничаването на специализираните клетъчни линии и клетъчната диференциация, се активират само около 30 от 500 гена, чиито продукти осигуряват връзката на клетката с околната микросреда. Чрез метода на сериен анализ на генната експресия беше показано, че при съвместната работа на основните функционални кутии на генома, регулиращи енергетиката и метаболизма в соматичните клетки и ESC, последните имат много ниско ниво на mRNA на рецептори, G протеини, вторични месинджъри, транскриптази, кофактори на експресия и репресия, т.е. цялата система за трансмембранно предаване на регулаторния сигнал към клетката. Това се дължи на липсата или много ниската експресия на транссигнални гени. По време на периода на индуцирана диференциация в генома на ЕСК, 18 функциониращи гена синхронно спират да работят на фона на активиране на 61 транссигнални гена, контролиращи синтеза на рецептори за клетъчна адхезия, компоненти на извънклетъчната матрица, рестрикционни транскриптази и мессенджерни елементи на системата за предаване на сигнали към ядрения апарат от рецепторите на клетъчната плазмена мембрана. В същото време се блокира експресията на гени, отговорни за синтеза на заглушителни протеини, както и на ко-инхибитори на генната експресия, които осигуряват тотипотентността на генома на ЕСК.

Генни маркери са открити за клетки от всичките три зародишни слоя. Идентифицирането на ектодермалния клетъчен слой се осъществява чрез експресията на гените nodal, oct3 и fgf-5, на мезодермалните клетки - чрез гените brachyury, zeta-globin, а на ендодермата - чрез експресията на гена gata-4. При нормална ембриогенеза по време на гаструлационния период се наблюдава активна миграция на незрели популации от стволови и прогениторни клетки, локално маркиращи зоните на развитие на лицевите кости на черепа, някои части на мозъка, периферната нервна система, сърдечната проводна система и тимуса, чиито тъкани се формират от клонове на мигриращи клетки. Маркирането на клетките от ранните гени на зародишните слоеве улеснява задачата за топографски анализ на процесите на миграция на клетки-прекурсори в развиващия се ембрион. Установено е, по-специално, че в агрегати от ембриокарциномни клетки P19, експресията на първия мезодермен ген брахиурия започва по време на периода на намалена експресия на гените на тъканния плазминогенен активатор, α-фетопротеина, кератин 8 и кератин 19, които са маркери на първите мигриращи мезодермални популации. Следователно, образуването на тъкани с мезодермален произход започва едва след завършване на процеса на точкова миграция и разпръскване на мезодермални прогениторни клетки.

Въпреки изключително ограничените фенотипни характеристики и липсата на повечето транс-сигнални единици, ембрионалните стволови клетки (ESC) все още експресират някои рецепторни молекули, които могат да бъдат използвани за тяхната идентификация. Прави впечатление, че маркерните антигени на ESC при хора и примати се оказаха често срещани. Най-често за маркиране на ESC се използват маркирани антитела към мембранно-свързани антигени SSEA-3, SSEA-4 (уникални липидни антигени, представляващи комплекс от гликолипид GL7 със сиалова киселина), както и високополимерни гликопротеини TRA-1-81, TRA-1-60. Освен това, ESC експресират специфичния ембрионален антиген SSEA-1 и ендогенната алкална фосфатаза, както и специфичния транскрипционен фактор Oct4. Последният е необходим за поддържане на механизмите на пролиферация на ESC - специфичният транскрипционен фактор Oct4 активира експресията на гена на фибробластния растежен фактор 4 и стабилизира експресията на кутията от гени, отговорни за неограничената репликация на ДНК в незрели клетки. Най-важните вътреклетъчни маркерни протеини са Oct3, Oct4, Tcf и Groucho, които са свързани с протеините за заглушаване на хроматина.

Почти веднага след многогодишни успешни опити за култивиране на ембрионални стволови клетки (ESC) извън тялото и получаването на първите култури от стволови клетки, изолирани от миши бластоцисти, и култури от първични зародишни клетки, започва етап на изследване на плурипотентния потенциал на ESC, когато те се въвеждат в ембриони в ранни стадии на развитие. Показано е, че на етапите морула и бластоциста ESC са способни да образуват химерни ембриони, в които потомците на донорските ESC се откриват във всички соматични тъкани и дори в гамети. По този начин, в биологията на развитието, използвайки ESC, се установява „мост“ между експериментални изследвания in vivo и in vitro, което значително разширява възможностите за изучаване на процесите на полагане на първични тъкани и органи, тяхната диференциация и ембрионална органогенеза.

Ясно е установено, че in vivo по време на ембриогенезата, ембрионалните стволови клетки (ESC) се интегрират в клетъчната маса на ранния ембрион, а техните производни се откриват във всички органи и тъкани. ESC колонизират линия от зародишни клетки в химерния ембрион, чиито потомци образуват пълноценни яйцеклетки и сперматозоиди. Ембрионалните стволови клетки са клоногенни - една единствена ESC е способна да създаде генетично идентична колония от клетки с молекулярни маркери, които включват експресия на гена oct4 и алкална фосфатаза, висока теломеразна активност и експресия на определени ембрионални антигени.

За изследване на механизмите на ембриогенезата с помощта на ембрионални стволови клетки (ESC) е разработен метод за химеризация на морулата чрез създаване на биологична конструкция, извън която има слой от реципиентни тетраплоидни бластомери, а вътре се въвеждат донорни ESC. По този начин, трофобластът се формира от потомците на тетраплоидните бластомери на реципиента, което осигурява имплантация и плацентация, а донорните ESC действат като вътрешна клетъчна маса, от която се формират тялото на жизнеспособен ембрион и линия от първични прогениторни зародишни клетки. Изследователската стойност на ESC се състои не само във факта, че плурипотентността се запазва по време на in vitro манипулации с техния геном, но и във факта, че се запазва способността на ESC да участват във формирането на първични зародишни клетки на химерен ембрион. Показано е, че потомците само на една генетично модифицирана ESC заселват всички първични зачатъци и развиващи се тъкани на химерен ембрион, получен чрез агрегация или кокултивиране на тази клетка с 8-клетъчен ембрион. Когато ESC, трансфектирани с гена на зеления флуоресцентен протеин, бяха трансплантирани в морулата на мишки, флуоресцентни потомци на тази клетка бяха открити във всички изследвани тъкани на развиващия се ембрион (Shimada, 1999). Трансплантацията на ESC в морулата позволява създаването на жизнеспособни мишки, чийто организъм се състои само от потомците на ESC на донора, което отваря перспективи за различни варианти за терапевтично клониране. Този методологичен подход сега се използва успешно за изучаване на проблеми на биологията на развитието, по-специално, той се използва за анализ на механизмите на генетична инактивация на Х хромозомата или епигенетична нестабилност на ESC. Трансплантацията на ESC в ранен ембрион се използва и в селскостопанската биотехнология, както и в експерименти с генна терапия.

Трансплантацията на генетично модифицирани ембрионални стволови клетки (ESC) се използва за тестване на целеви клетки на мутантни гени. Култивираните in vitro ESC се използват в биотехнологиите за създаване на нокаут мишки. За тази цел генът, който ще се изучава, се отстранява от ESC чрез хомоложна рекомбинация (нокаут) и клетките, на които липсва този ген, се изолират върху селективна среда. След това нокаут ESC се въвеждат в бластоцистата или се агрегират с бластомери на морула. Получените по този начин химерни ранни ембриони се трансплантират в реципиентни женски, а индивиди с гамети, нулизиготни за даден ген, се избират измежду новородените мишки. Тази технология е използвана за създаване на много линии нокаут мишки, които се използват широко в експерименталната биология и експерименталната медицина. Такива биологични модели се използват за изучаване на значението на определени гени в ембрионалното развитие, както и тяхната роля в механизмите на човешките заболявания и патологични състояния. Освен това, нокаут животински линии се използват в предклиничното тестване на нови методи за генна терапия. Например, чрез трансфектиране на нормалния алел на мутантен ген в генома на ESC е възможно ефективно да се коригира мутация, засягаща хематопоетичната система. Въвеждането на чужди гени в ембрионалните стволови клетки (ESC) позволява бързото създаване на линии от хомозиготни трансгенни лабораторни животни. Трябва да се отбележи обаче, че техниката на целенасочена рекомбинационна делеция на гени досега е надеждно разработена само по отношение на миши ESC. С помощта на двойно нокаутирани миши ESC беше установена функционалната роля на генния клъстерен регион на хромозома 7 (копие на геномния регион на човешка хромозома 19) и проксималния регион на хромозома 11 (копие на човешка хромозома 5g) - делецията на тези гени в миши ESC направи възможно да се оцени функцията на техните аналози при хората.

Разшириха се възможностите за изучаване на функцията на гените за човешка ембриогенеза, чиято трансфекция в генома на ембрионални стволови клетки (ESC) на лабораторни животни позволи, по-специално, да се изясни ролята на крипто гена във формирането и развитието на кардиогенния мезодерм, а генът pax-6 - в очната ембриогенеза. Съставят се първите карти на генната експресия в незрели пролифериращи ESC на тератокарцином и бластоцисти на мишки, потвърдена е и супресивната репресия на транссигналните гени в ESC. Комбинация от 60-80 мутантни ESC и 20-30 клетки от нормални преимплантационни миши ембриони води до развитието на химерни ембриони, в които органните зачатъци се състоят от донорски и реципиентни клетки, което позволява да се изясни ролята на неизвестни гени в гаструлацията и органогенезата. Функционалната карта на гените на развиващите се миши ембриони беше допълнена с информация за ролята на гена sf-1 във формирането на надбъбречната жлеза и гонадите, гена wt-1 във формирането на бъбреците, гените от семейството myoD във формирането на скелетните мускули и гените от семейството gata-1-4 в рестрикционното съзряване на рудиментите на еритропоезата и лимфопоезата.

Насоченото изключване на майчините и бащините алели на гени в ембрионалните стволови клетки (ESC) с помощта на векторни рекомбинази позволи да се изяснят функциите на различни гени в ранния период на ембриогенезата, а технологията на насочен трансфер на неизвестни човешки гени в миши ESC допринася за откриването на нови мутантни гени, отговорни за развитието на тежка наследствена патология. С помощта на метода на нокаут е определено задължителното значение на някои гени за образуването на ембрионални тъкани: gata-4 - за миокарда, gata-1 - за еритроидния ред на хематопоетичната тъкан, myoD - за скелетните мускули, brachyury - за мезодермата, рестрикционните транскриптази hnf3 и hnf4 - за чернодробните стволови клетки, rag-2 - за образуването на Т- и В-лимфоцитни клонове (Repin, 2001). Двойното заличаване на гени в ESC отвори достъп до изучаването на функционалната роля на гените на зародишния слой, сегментацията и хомеозата, а трансплантацията на ESC направи възможно получаването на жизнеспособни междувидови хибридни ембриони. С помощта на подобрена техника за трансплантация на единична донорска ембрионална стволова клетка (ESC) в 8-клетъчен ембрион е доказан фактът на химеризация на клетъчно ниво на много органи на реципиентния ембрион. Трябва да се отбележи, че след въвеждането на човешки хематопоетични стволови клетки в бластоцистата в органите на реципиентни мишки са открити клетъчни кълнове от човешка тъкан. Установено е, че плурипотентните ESC циркулират в кръвта на миши ембриони по време на периода на формиране на органите. Възможно е тяхната биологична функция да се крие в ембрионалната организация на бъдещата имунна система. С помощта на ESC в лабораторни условия са възпроизведени адекватни модели на човешка генетична патология: двоен нокаут на гена на дистрофина, моделиран при мускулна дистрофия на Дюшен при мишки, и изключване на гена atm (контрол на синтеза на хроматин сигнална киназа) - атаксия-телангиектазия. При това фатално наследствено заболяване при деца се развива дегенерация на клетките на Пуркиние в малкия мозък поради дефекти в репарацията на ДНК, която е съпроводена с инволюция на тимуса поради смъртта на пролифериращите клетки. Клиничната картина, патофизиологията и патоморфологията на атаксия-телангиектазията, възпроизведена чрез въвеждане на патологична генетична информация в ембрионалните стволови клетки (ESC), при химерни мишки съответстват на тези при хората. В допълнение към атаксия-телангиектазията, с помощта на ESC и нокаут мишки са разработени експериментални модели на някои наследствени хомозиготни човешки заболявания, свързани с патология на въглехидратния и липидния метаболизъм, катаболизма на аминокиселините и екскрецията на мед и билирубин, което значително разшири възможностите на експерименталната медицина на етапа на предклинично тестване на нови методи за лечение на съответните човешки заболявания.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Използване на цитохибриди на стволови клетки

Хибридните клетки, получени чрез сливане на ембрионални стволови клетки (ESC) със соматични клетки, са адекватен и обещаващ модел за изучаване на плурипотентността на стволови клетки и препрограмиране на хромозомите на диференцирани клетки. Цитохибридите, получени чрез сливане на ESC с диференцирани клетки на възрастно животно, позволяват изучаването на връзките между геноми от различна „възраст“: възниква уникална ситуация, когато хомоложни хромозоми, произхождащи от клетки на различни етапи на диференциация и различна степен на зрялост, се намират в едно и също ядро, където те могат лесно да обменят транс-активиращи регулаторни сигнали. Трудно е да се предвиди как цисрегулаторните епигенетични системи на хомоложни хромозоми, образувани по време на индивидуалното развитие, ще реагират на влиянието на транс-активиращите сигнали, излъчвани от ембрионално свързани геноми. Освен това в хибридните клетки се наблюдава сегрегация на родителските хромозоми, което ни позволява да изучаваме взаимодействието на геномите на ниво отделни хромозоми, т.е. потенциално да идентифицираме участието на специфични хромозоми в поддържането на плурипотентност или, обратно, изхода към диференциация.

Цитохибридите, получени чрез сливане на плурипотентни тератокарциномни и диференцирани соматични клетки, бяха използвани като първият експериментален модел за изучаване на взаимодействието на геноми с различна „история на развитие“. В някои случаи такива хибридни клетки запазиха плурипотентни свойства на доста високо ниво. По-специално, in vivo хибридните клетки на тератокарцином-соматични клетки индуцираха развитието на истински тератоми, съдържащи производни на всичките три зародишни слоя, а in vitro в суспензионни култури те образуваха ембриоидни телца. Дори при междувидови цитохибриди от този тип е наблюдавано наличието на ембрионални антигени в случаите, когато соматичните партньори при сливането с тератокарциномни клетки бяха лимфоцити или тимоцити. Прави впечатление, че цитохибридите, създадени чрез сливане на тератокарциномни клетки с фибробласти, съответстваха на фибробластите по фенотип.

Най-важният установен факт е, че в хибридните клетки на тератокарцином-соматични клетки се появяват признаци на препрограмиране на диференцирания клетъчен геном, което се характеризира с реактивиране или на отделни гени, или на неактивната Х хромозома на соматичния партньор. По този начин, резултатите от изследвания върху цитохибриди от типа тератокарцином-соматични клетки показват, че плурипотентността често се запазва в хибридните клетки и има признаци на препрограмиране на генома на соматичния партньор.

В експерименти за получаване на вътревидови ембрионални хибридни клетки чрез сливане на миши ембрионални стволови клетки (ESC) с възрастни спленоцити са изследвани характеристиките на такива цитохибриди, анализирана е сегрегацията на родителските хромозоми и е оценена плурипотентността на хибридния геном. Вътревидовите хибридни клетки, получени чрез сливане на тератокарциномни клетки със соматични клетки, обикновено се характеризират с ниско ниво на хромозомна сегрегация с тетраплоиден или почти тетраплоиден кариотип. Подобен хромозомен състав е наблюдаван при цитохибридите по време на сливането на първични зародишни клетки с лимфоцити. В същото време, междувидовите хибридни клетки, получени чрез сливане на миши тератокарциномни клетки с лимфоцити от норка, показват интензивна сегрегация на хромозомите на соматичния партньор.

Качествено нов етап в изследването на сегрегацията на родителските хромозоми при интравидови хибриди започна след разработването на метод за анализ на микросателити, използващ полимеразна верижна реакция, благодарение на който бяха открити няколкостотин маркера за всяка миша хромозома, позволяващи надеждна дискриминация на всяка двойка хомоложни хромозоми в хибридни клетки.

Чрез сливане на ембрионални стволови клетки (HM-1 клетки с дефицит на хипоксантин фосфорибозилтрансферазна активност, 2n = 40, XY, изолирани от бластоцисти на 129/01a мишки) със спленоцити на конгенетичните DD/c мишки, беше възможно да се получи набор от хибридни клонове, морфологично подобни на ембрионалните стволови клетки. Всички клонове бяха изолирани върху селективна среда, в която могат да растат само клетки с активна хипоксантин фосфорибозилтрансфераза. Електрофоретичният анализ показа, че всички клонове имат алелен вариант на хипоксантин фосфорибозилтрансфераза, характерен за DD/c мишки. Цитогенетичният анализ показа, че три от четирите хибридни клона имат почти диплоиден набор от хромозоми. Един почти тетраплоиден клон съдържа две популации от хибридни клетки, едната от които е тетраплоидна, а втората, по-малка, е диплоидна.

Микросателитният анализ, който позволява дискриминация на всяка двойка хомоложни хромозоми на мишки 129/01a и DD/c, в хибридни клонове с почти диплоиден набор, показа, че в два клона е налице ясно изразено преференциално елиминиране на автозоми на соматичния партньор. Повечето автозоми в клонове HESS2 и HESS3 имат маркери от линията 129/01a, т.е. плурипотентния партньор. Изключение правят хромозоми 1 и I: в клонове HESS2 и HESS3, наред с маркери на HM-1 клетки, маркери на соматичния партньор присъстват в малки количества. Такива резултати могат да отразяват непълна сегрегация на хромозоми 1 и I на соматичния партньор и са в съответствие с цитогенетичните данни, че тризомия за тези хромозоми се наблюдава в 30-40% от клетките на клонове HESS2 и HESS3. Клонът HESS4 се различаваше значително по своя хромозомен състав: много автозоми в този клон произхождат от ESC генома (хромозоми 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 и 17), но хромозоми 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 и 19 бяха представени от хомолози и на двамата родители. Количественото съотношение на микросателитите, маркиращи тези хомоложни хромозоми, беше приблизително 1:1. Това позволи на авторите да предположат, че единият хомолог произхожда от ESC генома, а другият - от диференцирани клетки. В някои субклонове на клон HESS4 присъстваха само маркери на хромозоми 18 и 19 на соматичния партньор. Получените резултати показват, че в клетките на HESS4 клона, освен сегрегацията на хромозомите на соматичния партньор, е настъпило елиминиране на един или и на двата хомолога на гореспоменатите хромозоми на плурипотентния геном, т.е. е налице двустранна сегрегация на хромозомите и на двамата родители - много необичайно явление, тъй като сегрегацията на хромозомите само на единия от родителите е характерна за цитохибридите.

Освен това, след 20-ия пасаж, всички клонинги на хибридни клетки съдържаха само маркери на Х хромозомата на соматичния партньор, т.е. ESC Х хромозомата беше заменена от Х хромозомата на соматичния партньор в клонингите. Този важен факт се потвърждава от данни от in situ хибридизация, използващи FITC-маркирана сонда, специфична за мишата Х хромозома: положителен сигнал беше открит само на една хромозома. Трябва да се отбележи, че на по-ранни етапи на култивиране (преди 15-ия пасаж), според цитогенетичните данни, много клетки съдържаха две Х хромозоми. Следователно, използването на селективни среди позволява манипулиране на хромозомния състав на хибридните клетки и селективно селектиране на клонинги, носещи единични хромозоми на соматичния партньор на фона на ESC генома.

Тъй като уникална характеристика на цитохибридния геном е локализацията на родителските геноми в едно ядро, естествено възниква въпросът за запазването на плурипотентните свойства на ембрионалния геном в хибридите на ембрионалните стволови клетки (ESC) и соматичните клетки при условия на близък контакт с генома на диференцирана клетка. Морфологично, цитохибридите на ESC и соматичните клетки са подобни на родителската ESC линия. Оценката на плурипотентността показва, че всички клонове с почти диплоиден набор от хромозоми са способни да образуват ембриоидни тела в суспензионни култури, в които присъстват производни на три зародишни слоя.

Повечето хибридни клетки съдържаха антигена ECMA-7, маркер, характерен за ранните миши ембриони, и също така притежаваха висока алкална фосфатазна активност. Най-убедителните данни за високите плурипотентни свойства на хибридните клетки бяха получени в експерименти за получаване на серия от инжекционни химери, включващи хибридни клетки от HESS2 клона. Анализът на биохимичните маркери показа, че потомците на донорските хибридни клетки присъстват в повечето тъкани на химерите. Следователно, хибридните клетки, получени чрез сливане на ембрионални стволови клетки (ESC) и соматично диференцирани клетки, запазват плурипотентност на високо ниво, включително способността да образуват химери, когато се инжектират в кухината на бластоцистата.

Клоновете HESS2 и HESS4 се различаваха значително по състава на родителските хромозоми, но имаха сходни плурипотентни свойства. Може да се предположи, че плурипотентността в хибридния геном се проявява като доминиращ белег, но е възможно не всички хромозоми от ембрионалния геном да участват в процеса на поддържане на плурипотентност. Ако това предположение е вярно, тогава може да се очаква, че елиминирането на някои хромозоми на плурипотентния партньор от генома на хибридните клетки няма да бъде съпроводено с промяна в техния плурипотентен статус. В този случай, анализът на сегрегацията на родителските хромозоми в ембрионални хибридни клетки би ни позволил да се доближим по-отблизо до идентифицирането на хромозомите, отговорни за контрола на плурипотентността на ембрионалните клетки.

О. Серов и др. (2001) не откриват потомство сред 50 потомци, получени чрез кръстосване на химери с нормални мишки, които имат миши генотип 129/01a и носят X хромозомата на DD мишки. Авторите смятат, че това се дължи на намаляване на плурипотентността в хибридните клетки под влияние на соматичния геном. Алтернативно обяснение може да бъде отрицателният ефект на тризомията върху някои автозоми и дисбалансът в половите хромозоми (XXY са наблюдавани в клетки до 15-ия пасаж) в хибридните клетки по време на мейозата. Известно е, че XXY клетките не са способни да претърпят мейоза и да образуват гамети. Тризомията може също да причини намаляване на пролиферативната активност на хибридните клетки, в резултат на което селективното предимство при развитието на химери може да принадлежи на клетките на реципиентния ембрион. От това следва, че за адекватна оценка на плурипотентния потенциал на хибридните клетки е необходимо да се получат хибридни клонове с нормален диплоиден набор от хромозоми.

В експериментите на О. Серов и съавтори (2001) за първи път е демонстрирана възможността за препрограмиране на Х хромозомата на соматична клетка в генома на хибридните клетки. Това заключение на авторите следва от анализа на експресията на гена hprt (маркер на Х хромозомата) в химери: наличието на алелен вариант на hprt на DD/c мишки е открито във всички анализирани химерни тъкани. Уместно е да се подчертае, че след въвеждането на хибридни клетки в кухината на бластоцистата, цитохибридите попадат в неселективни условия и запазването на Х хромозомата в генома на хибридните клетки означава, че тя се е превърнала в неин облигатен компонент и геномът не я дискриминира от Y хромозомата на плурипотентния партньор.

Обобщавайки резултатите от анализа на взаимодействието на соматичните и плурипотентните геноми в хибридните ембрионални клетки, авторите заключават, че при някои цитохибриди плурипотентността се проявява като доминиращ белег. Хибридният геном е способен да препрограмира отделни хромозоми на диференцирани клетки, което обаче не изключва възможността за обратен ефект на соматичния геном върху плурипотентността на ембрионалния геном. При култивиране на хибридни клетки, индуцирането на диференциация се случва значително по-често, отколкото в оригиналната родителска линия на ембрионални стволови клетки HM-1. Подобен ефект се наблюдава и по време на образуването на първични колонии: много първични колонии от ембрионални хибридни клетки се диференцират в ранните етапи на формиране с големи загуби на клонинги по време на тяхната селекция и размножаване.

По този начин, цитохибридите, създадени чрез сливане на ембрионални стволови клетки (ESC) със соматични клетки, въпреки близкия контакт с генома на диференцираните клетки, запазват плурипотентността си като уникално свойство на ембрионалния геном. Освен това, в такива хибридни клетки е възможно препрограмирането на отделни хромозоми, произхождащи от диференцирани клетки. Остава неясно до каква степен плурипотентните свойства на ембрионалния геном се запазват в хибридните клетки, по-специално способността им да участват във формирането на зародишната линия при химерите. Това изисква получаване на ембрионални хибридни клетки с нормален кариотип. Във всеки случай, плурипотентните ембрионални хибридни клетки могат да се превърнат в реален генетичен модел за идентифициране на хромозоми, участващи в поддържането на плурипотентността или нейното контролиране, тъй като двустранната сегрегация на родителските хромозоми потенциално предоставя такава възможност.

Не по-малко привлекателно е изследването на феномена, който О. Серов и др. (2001) определят като „хромозомна памет“. В хибридния геном хомоложните хромозоми се намират в две алтернативни конфигурации: хомолозите на соматичния партньор веднъж са претърпели диференциация, докато при хомолозите на плурипотентния партньор този процес едва сега започва. Следователно, запазването на високи плурипотентни свойства от хибридните клетки показва, че „плурипотентната“ конфигурация на ESC хомолозите е достатъчно стабилна в хибридния геном, въпреки влиянието на трансакционни фактори, произтичащи от соматичния партньор. Описаните по-горе признаци на препрограмиране на хомоложни хромозоми на диференцирания геном по време на развитието на химери не изключват възможността в първите етапи на формиране и култивиране на цитохибриди in vitro те да запазят статуса си, придобит по време на диференциацията in vivo. Според наскоро получени данни, когато ембрионалните хибридни клетки се прехвърлят в неселективна среда, те показват интензивно елиминиране на хромозоми само на соматичния партньор, т.е. геномът на хибридните клетки лесно дискриминира хомолозите след in vitro култивиране в продължение на 10-15 пасажа. По този начин, ембрионалните хибридни клетки представляват обещаващ експериментален модел за изучаване не само на такова фундаментално свойство на ембрионалния геном като плурипотентността, но и на неговата алтернатива - ембрионална диференциация.

Терапевтична ефикасност на трансплантацията на ембрионални стволови клетки

Преди да анализираме терапевтичната ефикасност на трансплантацията на ембрионални стволови клетки (ESC) и техните производни, обобщаваме горния материал. Възможностите на ESC по отношение на пълноценното осъществяване на ембриогенезата in vitro са недостатъчни, тъй като дефектите в развитието в този случай се дължат на липсата на мезенхимни стволови клетки, които възникват в организма автономно и независимо от ESC. Генетичният потенциал на ESC е по-малък от генетичния потенциал на зиготата, следователно ESC не се използват директно за клониране на ембриони. Уникалният биологичен потенциал на ESC като единствените клетки, в които програмите за развитие са напълно разгърнати в последователно изпълнение, се използва в изследванията на генната функция. С помощта на ESC се декодират първите комбинации от сигнали, активиращи експресията на ранни и късни гени, кодиращи развитието на три зародишни слоя. Запазването на плурипотентността на генома на ESC in vitro ги прави уникален инструмент за репаративна регенерация, способен автоматично да попълва клетъчните загуби в случай на увреждане на органи и тъкани. В идеален хипотетичен сценарий може да се предположи, че „... при трансплантация на донорски ембрионални стволови клетки (ESC), в тялото на реципиента се пренасят компактно опаковани програми, които при благоприятни условия се реализират в изграждането на нова тъкан“7, способна „... да бъде ефективно интегрирана в тялото на реципиента както на морфологично, така и на функционално ниво“.

Естествено, след разработването на методи за монодиференциация на ембрионални стволови клетки (ESC), започна in vivo изследване на функционалната активност на клетки, получени in vitro от един специализиран клон. Пролифериращ ESC клон генерира популации от мигриращи прогениторни клетки, които са наистина способни активно да се интегрират в области на увреждане на тъканите на реципиента, което се използва в регенеративно-пластичната медицина. Установено е, че трансплантацията на DOPA неврони в substantia nigra намалява клиничните прояви при експериментален хемипаркинсонизъм. Регионалните трансплантации на донорски невронни стволови клетки намаляват степента на двигателни нарушения, причинени от травма или контузия на гръбначния мозък и мозъка. Получени са и първите положителни резултати от трансплантацията на стволови клетки при демиелинизиращи заболявания. Изглежда, че регенеративно-пластичният потенциал на ESC отваря неограничени възможности за използване на клетъчната трансплантация в практическата медицина. Въпреки това, когато се трансплантират в ектопични зони, ESC неизбежно се трансформират в тумори. Тератоми се образуват, когато ESC се инжектират подкожно в имунодефицитни мишки. Когато суспензии от ембрионални стволови клетки (ESC) се трансплантират под капсулата на тестиса при сингенни мишки, се образуват и тератоми, състоящи се от различни тъкани, чиито клетки са производни на трите зародишни слоя. При такива тератоми процесите на намалена органогенеза са изключително редки.

Редица проучвания предоставят информация за положителните резултати от трансплантацията на ранни производни на ембрионални стволови клетки (ESC) на животни с експериментална патология. Клетъчната невротрансплантация с използване на ESC производни се доразвива в експерименти и първите клинични изпитвания за коригиране на функционални нарушения при мозъчни и гръбначни увреждания, както и за лечение на сирингомиелия и множествена склероза (Repin, 2001). С появата на техниката на in vitro неврогенеза от ESC, вместо да се използва ембрионална мозъчна тъкан, се разработват методи за трансплантация на невросферни производни, получени от ембрионални нервнотъканни култури. Такива трансплантационни суспензии са значително по-хомогенни и съдържат ангажирани прекурсори на неврони и невроглия.

При редовно добавяне на ретиноева киселина в доза от 10 μg/ml към културалната среда в продължение на 6 седмици, в линията NTERA-2 на човешкия ембрио-(терато)-карцином се формират повече от 80% от постмитотичните неврони. Пълната хомогенност на невронната популация се постига чрез сортиране на потока от зрели неврони, маркирани с имунофенотипни маркери, което позволява да се отървете от остатъците от тератокарцином и незрели клетки. След трансплантация в различни области на мозъка на експериментални животни, такива неврони не само оцеляват, но и се интегрират в регионални невронни мрежи. При животни с експериментални модели на локални дефекти на ЦНС, невротрансплантацията намалява клиничните прояви на такива човешки патологии като последствия от травматично мозъчно увреждане, инсулт, демиелинизиращи заболявания, наследствени дефекти в развитието на малкия мозък, заболявания на отлагането на липиди и полизахариди.

За оптимизиране на процесите на регенерация при дегенеративни заболявания на централната нервна система се разработват технологии за получаване на миелин-продуциращи олигодендроцити от ембрионални стволови клетки (ESC). Първият етап традиционно включва пролиферация на ESC с възпроизвеждане на броя клетки, необходими за трансплантация. На втория етап се извършва целенасочена диференциация на клетките в популация от миелин-продуциращи олигодендроцитни прекурсори, която се контролира от селективни маркерни антигени.

Отварят се определени перспективи за използването на ESC производни за разработване на методи за коригиране на имунодефицити, причинени от генетични дефекти в зреенето на тимуса. В проучвания върху нокаут (rag 1) мишки с индуциран генен дефект - нарушаване на механизма на рекомбинация на V(D)J локуси на TCR гени, водещо до загуба на T-лимфоцитна функция, трансплантацията на ранни ESC производни в тимуса на животни възстановява зреенето на нормални популации от имунни клонове, отговорни за клетъчния имунитет. Клиничните изпитвания на трансплантация на in vitro преформирани ESC за лечение на фатални наследствени анемии при деца са в ход.

Възраженията срещу бързото въвеждане на трансплантацията на стволови клетки в клиниката се основават на ограничения брой стабилни линии от човешки ембрионални стволови клетки и необходимостта от тяхната стандартизация. За да се повиши чистотата на стандартизираните ESC линии, както и на възрастни човешки стволови клетки, се предлага да се използва метод за селекция на линии, базиран на молекулярно-генетичен анализ на къси тандемни ДНК повторения. Необходимо е също така да се тестват ESC линиите за наличие на малки хромозомни пренареждания и генетични мутации, чийто потенциал за възникване в условия на клетъчна култура е доста висок. Излага се теза за задължителното тестване на свойствата на всички видове ESC и регионални плурипотентни стволови клетки, тъй като тяхното размножаване in vitro може да доведе до появата на нови характеристики, които не са присъщи на ембрионалните стволови клетки или дефинитивните тъкани. По-специално се приема, че дългосрочното култивиране в среда с цитокини доближава ESC линиите до туморните клетки, тъй като те претърпяват подобни промени в пътищата на регулиране на клетъчния цикъл с придобиване на способността да извършват неограничен брой клетъчни деления. Някои автори, въз основа на потенциала за развитие на тумор, считат трансплантацията на ранни ембрионални стволови клетки в хора за безразсъдна. Според тях е много по-безопасно да се използват ангажирани потомци на ембрионални клетъчни клетки (ESC), т.е. линии от диференцирани клетъчни прогенитори. Въпреки това, в момента все още не е разработена надеждна техника за получаване на стабилни човешки клетъчни линии, които се диференцират в желаната посока.

По този начин в литературата се появяват все повече данни за положителния терапевтичен ефект от трансплантацията на производни на човешки ембрионални стволови клетки. Много от тези изследвания обаче са обект на преглед и критика. Някои изследователи смятат, че резултатите от ранните клинични изпитвания са предварителни по своята същност и само показват, че стволовите клетки са способни да окажат благоприятен ефект върху клиничния ход на определено заболяване. Следователно е необходимо да се получат данни за отдалечените резултати от клетъчната трансплантация. Като аргумент се посочват етапите на развитие на клиничната невротрансплантология. Всъщност, в началото в литературата преобладават публикации за високата ефективност на трансплантацията на ембрионални мозъчни фрагменти при болестта на Паркинсон, но след това започват да се появяват съобщения, отричащи терапевтичната ефективност на ембрионална или фетална нервна тъкан, трансплантирана в мозъка на пациенти.

Първите клинични изпитвания бяха проведени за оценка на безопасността на трансплантацията на невробласти, получени от ембрионални стволови клетки (ESC) на тератокарцином NTERA-2, чиито незрели клетки бяха подложени на пролиферация в култура до натрупване на 100 милиона клетъчна маса. Някои от получените по този начин клетки бяха използвани за характеризиране на фенотипа и определяне на клетъчни примеси, както и за тестване за евентуално замърсяване с вируси и бактерии. LIF и захранващият слой от фетални стромални клетки бяха отстранени от хранителната среда и бяха създадени условия за целенасочена диференциация на ESC в невробласти, използвайки комбинация от цитокини и растежни фактори. След това невробластите бяха пречистени от незрели тератокарциномни клетки на проточен клетъчен сортировчик. След вторично пречистване и фенотипна характеристика на трансплантираните клетки, суспензия от невробласти (10-12 милиона) беше инжектирана в базалното ядро на мозъка на пациентите (на седмия месец след хеморагичен инсулт) с помощта на специална микроканюла и спринцовка под стереотаксичен и компютърно-томографски контрол. Едногодишният скрининг след трансплантация на последствията от трансплантацията на неврони в зоната на инсулта не разкри никакви странични или нежелани ефекти. Половината от пациентите показаха подобрение в двигателната функция в периода от 6 до 12 месеца след трансплантацията. Положителните клинични промени бяха съпроводени с повишено кръвоснабдяване на зоната на инсулта след клетъчна трансплантация: средното увеличение на абсорбцията на флуоресцентно белязана 2-деоксиглюкоза, според позитронно-емисионна томография, достигна 18%, а при някои пациенти - 35%.

Националните здравни институти на САЩ обаче проведоха независимо проучване на клиничната ефективност на невротрансплантацията при пациенти с паркинсонизъм. На пациентите от първата група бяха трансплантирани срези от ембрионална нервна тъкан, произвеждаща допамин, докато втората група пациенти претърпяха фалшива операция. Резултатите показват нулева клинична ефективност на такава невротрансплантация, въпреки факта, че ембрионалните неврони, произвеждащи допамин, са оцелели в мозъка на реципиентите. Освен това, 2 години след трансплантацията на ембрионална нервна тъкан, 15% от пациентите развиха персистираща дискинезия, която липсваше при пациентите от плацебо групата (Стволови клетки: научен прогрес и бъдещи насоки на изследване. Национален институт по здравеопазване. САЩ). Наблюденията за по-нататъшното развитие на заболяването при тези пациенти продължават.

Някои автори свързват противоречивите литературни данни относно оценката на клиничната ефективност на невротрансплантацията с различни подходи при подбора на групи пациенти, неадекватен избор на методи за обективна оценка на тяхното състояние и, най-важното, с различни периоди на развитие на ембрионалната нервна тъкан и различни области на мозъка, от които е получена тази тъкан, различни размери на трансплантата и методологични особености на хирургичната интервенция.

Трябва да се отбележи, че опитите за директна трансплантация на плурипотентни ембрионални стволови клетки в стриатумната област на мозъка на плъхове с експериментален хемипаркинсонизъм са били съпроводени с пролиферация на ембрионални стволови клетки (ESC) и тяхната диференциация в допаминергични неврони. Трябва да се предположи, че новообразуваните неврони са били ефективно интегрирани в невронните мрежи, тъй като след трансплантация на ESC е наблюдавана корекция на поведенчески аномалии и двигателна асиметрия в апоморфиновия тест. В същото време някои животни са починали поради трансформацията на трансплантираните ESC в мозъчни тумори.

Експерти от Националната и Медицинската академии на САЩ, специалисти от Националния институт по здравеопазване на САЩ смятат, че клиничният потенциал на ембрионалните стволови клетки (ESC) заслужава най-сериозно внимание, но настояват за необходимостта от детайлно проучване на техните свойства, вероятността от усложнения и дългосрочните последици в експерименти върху адекватни биологични модели на човешки заболявания (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press.; Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

От тази гледна точка е важно, че сравнителният хистологичен анализ на експериментални тератоми, получени чрез трансплантация на суспензия от ембрионални стволови клетки (ESC) в тестиса с тератоми, образувани в резултат на трансплантация на ранен ембрион, който също съдържа ESC, показа, че ESC, независимо от източника им на произход или взаимодействие с определени околни клетки, реализират своя туморогенен потенциал по един и същи начин. Доказано е, че такива тератоми имат клонален произход, тъй като тумори, състоящи се от производни на трите зародишни слоя, могат да възникнат от един ESC (Rega, 2001). Прави впечатление, че когато клонирани ESC с нормален кариотип са трансплантирани в имунодефицитни мишки, са се образували и тератоми, състоящи се от различни видове диференцирани соматични клетки. Тези експериментални данни са безупречно доказателство за клоналния произход на тератомите. От гледна точка на биологията на развитието, те показват, че не множество ангажирани прогениторни клетки, а една единствена плурипотентна стволова клетка действа като източник на диференцирани производни на трите зародишни слоя, които изграждат тератома. Въпреки това, по пътя към практическата клетъчна трансплантация, резултатите от тези изследвания са, ако не забранителен, то предупредителен знак за потенциална опасност, тъй като инокулирането на ембрионални стволови клетки (ESC) или първични зародишни клетки в различни тъкани на възрастни имунодефицитни мишки неизбежно води до развитието на тумори от трансплантирани стволови клетки. Неопластичната дегенерация на ектопично трансплантирани ESC е съпроводена с появата на сателитни популации от диференцирани клетки - поради частична диференциация на ESC и прогениторни клонове в специализирани линии. Интересното е, че когато ESC се трансплантират в скелетните мускули, невроните най-често се образуват до тератокарциномни клетки. Въвеждането на ESC в деляща се яйцеклетка или бластоциста обаче е съпроводено с пълна интеграция на клетките в ембриона без образуване на неопластични елементи. В този случай ESC се интегрират в почти всички органи и тъкани на ембриона, включително гениталния примордиум. Такива алофенни животни са получени за първи път чрез въвеждане на тератокарциномни 129 клетки в ранни ембриони на 8-100 клетъчни стадии. При алофенови мишки, популации от хетерогенни клетки, получени от донорски ембрионални стволови клетки (ESC), са интегрирани в тъканите на костния мозък, червата, кожата, черния дроб и гениталиите, което прави възможно създаването дори на междувидови клетъчни химери в експеримента. Колкото по-кратък е периодът на развитие на ранния ембрион, толкова по-висок е процентът на клетъчна химеризация, като най-висока степен на химеризация се наблюдава в хематопоетичната система, кожата, нервната система, черния дроб и тънките черва на алофеновия ембрион. В възрастен организъм тъканите, защитени от имунната система на реципиента чрез хистохематични бариери, са податливи на химеризация:Трансплантацията на първични зародишни клетки в тестикуларния паренхим е съпроводена с включване на донорски стволови клетки в слоя зародишна тъкан на реципиента. При трансплантация на ембрионални стволови клетки (ESC) в бластоциста обаче не се наблюдава образуване на химерни рудименти на половите органи с генерирането на донорски първични зародишни клетки. Плурипотентността на ESC, когато се създават специални условия, може да се използва и за клониране: трансплантирането на миши ESC в 8-16-клетъчен миши ембрион, при който клетъчните митози са блокирани от цитокалзин, насърчава осъществяването на нормална ембриогенеза с развитието на ембрион от донорски ESC.

Следователно, алтернатива на алогенната трансплантация на ембрионални стволови клетки (ESC) е терапевтичното клониране, основано на трансплантация на соматични клетъчни ядра в енуклеирана яйцеклетка, за да се създаде бластоциста, от чиято вътрешна клетъчна маса след това се изолират линии от ESC, генетично идентични с донора на соматичното ядро. Технически тази идея е напълно осъществима, тъй като възможността за създаване на ESC линии от бластоцисти, получени след трансплантация на соматични ядра в енуклеирани яйцеклетки, е многократно доказана в експерименти върху лабораторни животни (Nagy, 1990; Munsie, 2000). По-специално, при мишки, хомозиготни за мутацията на гена rag2, фибробласти, получени чрез култивиране на субепидермални тъканни клетки, са използвани като донори на ядра, които са трансплантирани в енуклеирани ооцити. След активирането на ооцитите, „зиготата“ е култивирана до образуване на бластоциста, от чиято вътрешна клетъчна маса са изолирани ESC и са прехвърлени в линия от клетки, нулизиготни за мутантния ген (rag2~/~). Мутацията на един алелен ген е коригирана в такива ембрионални стволови клетки (ESC) чрез метода на хомоложна рекомбинация. В първата серия експерименти ембриоидни тела са получени от ESC с рекомбинантен възстановен ген, техните клетки са трансфектирани с рекомбинантен ретровирус (HoxB4i/GFP) и след размножаване са инжектирани във вената на rag2~/~ мишки. Във втората серия тетраплоидни бластомери са агрегирани с генетично модифицирани ESC и трансплантирани в реципиентни женски мишки. Получените имунокомпетентни мишки служат като донори на костен мозък за трансплантация в rag2~/~ мутантни мишки. И в двете серии резултатът е положителен: след 3-4 седмици във всички мишки са открити зрели нормални миелоидни и лимфоидни клетки, способни да произвеждат имуноглобулини. По този начин, трансплантацията на соматични клетъчни ядра в ооцити може да се използва не само за получаване на ESC линии, но и за цитогенотерапия - коригиране на наследствени аномалии, използвайки ESC като вектор за транспорт на коригираща генетична информация. Но това направление на клетъчната трансплантация, освен биоетичните проблеми, има своите ограничения. Не е ясно колко безопасна ще бъде трансплантацията на терапевтично клонирани клетки с генотип, идентичен с генотипа на конкретен пациент, тъй като такива клетки могат да въведат мутации, които създават предразположеност към други заболявания. Нормалните човешки яйцеклетки остават труднодостъпен обект, докато дори при трансплантация на соматични ядра в енуклеирани животински яйцеклетки, само 15-25% от конструираните „зиготи“ се развиват до стадий на бластоциста. Все още не е определено колко бластоцисти са необходими за получаване на една линия от плурипотентни клонирани ембрионални стволови клетки (ESC). Заслужава да се отбележи и високото ниво на финансови разходи, свързани със сложността на методологията на терапевтично клониране.

В заключение, трябва да се отбележи, че при ембрионалните стволови клетки (ESC) плурипотентността на генома с хипометилирана ДНК се комбинира с висока теломеразна активност и кратка C^ фаза на клетъчния цикъл, което осигурява тяхното интензивно и потенциално безкрайно размножаване, по време на което ESC запазват диплоиден набор от хромозоми и „ювенилен“ набор от фенотипни характеристики. Клоновият растеж на ESC в култура не пречи на диференциацията им в която и да е специализирана клетъчна линия на организма, когато пролиферацията е спряна и са добавени подходящи регулаторни сигнали. Рестрикционната диференциация на ESC в соматични клетъчни линии in vitro се осъществява без участието на мезенхима, заобикаляйки Nochteys, извън органогенезата и без образуване на ембриони. Ектопичното въвеждане на ESC in vivo неизбежно води до образуване на тератокарциноми. Трансплантацията на ESC в бластоциста или ранен ембрион е съпроводена с тяхната интеграция с ембрионалните тъкани и стабилна химеризация на неговите органи.

Регенеративно-пластичните технологии, базирани на клетъчна трансплантация, са пресечната точка на интересите на представители на клетъчната биология, биологията на развитието, експерименталната генетика, имунологията, неврологията, кардиологията, хематологията и много други области на експерименталната и практическата медицина. Най-важните резултати от експериментални изследвания доказват възможността за препрограмиране на стволови клетки с целенасочена промяна в техните свойства, което открива перспективи за контролиране на процесите на цитодиференциация с помощта на растежни фактори - за миокардна регенерация, възстановяване на лезии на ЦНС и нормализиране на функцията на островния апарат на панкреаса. За широкото въвеждане на трансплантацията на ембрионални стволови клетки (ESC) в практическата медицина обаче е необходимо по-подробно изучаване на свойствата на човешките стволови клетки и продължаване на експериментите с ESC върху експериментални модели на заболявания.

Биоетичните въпроси и проблемът с отхвърлянето на алогенна клетъчна трансплантация биха могли да бъдат решени чрез откритата пластичност на генома на регионалните стволови клетки на възрастен организъм. Първоначалната информация, че при трансплантация на изолирани и внимателно характеризирани хематопоетични автоложни клетки в черния дроб, от които се получават нови хепатоцити, интегриращи се в чернодробните лобули, обаче сега се преразглежда и критикува. Въпреки това са публикувани данни, че трансплантацията на неврални стволови клетки в тимуса причинява образуването на нови донорски Т- и В-лимфоцитни кълнове, а трансплантацията на мозъчни неврални стволови клетки в костния мозък води до образуването на хематопоетични кълнове с дългосрочна донорска миело- и еритропоеза. Следователно, плурипотентни стволови клетки, способни да препрограмират генома с потенциала на ембрионални стволови клетки (ESC), могат да персистират в органите на възрастен организъм.

Източникът на получаване на ембрионални стволови клетки (ЕСК) за медицински цели остава човешкият ембрион, което предопределя неизбежността на ново пресичане на морални, етични, правни и религиозни въпроси в точката на зараждане на човешкия живот. Откриването на ЕСК даде мощен тласък за възобновяване на трудни дискусии за това къде е границата между живите клетки и материята, битието и личността. В същото време, няма универсални норми, правила и закони относно използването на ЕСК в медицината, въпреки многократните опити за създаването и приемането им. Всяка държава, в рамките на своето законодателство, решава този проблем самостоятелно. От своя страна, лекарите по света продължават да се опитват да изведат регенеративно-пластичната медицина извън обхвата на подобни дискусии, предимно чрез използването на резерви от възрастни стволови клетки, а не на ембрионални стволови клетки.

Малко история на изолирането на ембрионални стволови клетки

Клетки от терато(ембрио)карцином са изолирани от спонтанно възникващи тестикуларни тератоми на 129/ter-Sv мишки, спонтанни тератоми на яйчниците на Lt/Sv мишки и от тератоми, получени от ектопично трансплантирани ембрионални клетки или тъкани. Сред стабилните клетъчни линии от миши терато(ембрио)карцином, получени по този начин, някои са плурипотентни, други се диференцират само в един специфичен клетъчен тип, а някои са напълно неспособни на цитодиференциация.

По едно време фокусът беше върху изследвания, чиито резултати показваха възможността за връщане на терато-(ембрио)-карциномни клетки към нормален фенотип след въвеждането им в тъканите на развиващ се ембрион, както и работа по in vitro създаването на генетично модифицирани терато-(ембрио)-карциномни клетки, с помощта на които бяха получени мутантни мишки за биологично моделиране на човешка наследствена патология.

Култивиране в кондиционирана суспензия е използвано за изолиране на клетъчни линии от терато-(ембрио)-карцином. В култура, клетките от терато-(ембрио)-карцином, подобно на ембрионалните стволови клетки (ESC), растат, за да образуват ембриоидни телца и изискват задължителна дисоциация за трансфер на линия, поддържайки плурипотентност върху захранващ слой от ембрионални фибробласти или по време на култивиране в суспензия в кондиционирана среда. Клетките от плурипотентните линии от терато-(ембрио)-карцином са големи, сферични, характеризират се с висока алкална фосфатазна активност, образуват агрегати и са способни на многопосочна диференциация. Когато бъдат въведени в бластоциста, те агрегират с морулата, което води до образуването на химерни ембриони, в състава на които се намират производни на клетки от терато-(ембрио)-карцином. Въпреки това, по-голямата част от тези химерни ембриони умират in utero, а в органите на оцелелите новородени химери, чужди клетки се откриват рядко и с ниска плътност. В същото време, честотата на туморите (фибросарком, рабдомиосарком, други видове злокачествени тумори и панкреатичен аденом) се увеличава рязко, а туморната дегенерация често се случва по време на периода на вътрематочно развитие на химерните ембриони.

Повечето терато-(ембрио)-карциномни клетки в микросредата на нормалните ембрионални клетки почти естествено придобиват злокачествени неопластични характеристики. Смята се, че необратимото злокачествено заболяване се дължи на активирането на протоонкогени в процеса на структурни пренастройки. Едно от изключенията са клетките от ембриокарциномната линия SST3, получени от тестикуларни тератоми на мишки (линия 129/Sv-ter), които проявяват висока способност за интегриране в тъканите и органите на ембриона без последващо образуване на тумор при химерни мишки. Производните на клетъчните линии на терато-(ембрио)-карцином при химерни мишки практически не участват във формирането на първични гоноцити. Очевидно това се дължи на високата честота на хромозомни аберации, характерни за повечето терато-(ембрио)-карциномни линии, в клетките на които се наблюдават както анеуплоидия, така и хромозомни аномалии.

В лабораторни условия бяха получени няколко стабилни линии от човешки терато-(ембрио)-карциномни клетки, характеризиращи се с плурипотентност, висока пролиферативна активност и способност за диференциация по време на растеж в култури. По-специално, линията човешки терато-(ембрио)-карциномни клетки NTERA-2 беше използвана за изследване на механизмите на неврална цитодиференциация. След трансплантация на клетки от тази линия в субвентрикуларната област на предния мозък на новородени плъхове бяха наблюдавани тяхната миграция и неврогенеза. Дори бяха правени опити за трансплантация на неврони, получени чрез култивиране на клетки от терато-(ембрио)-карциномната линия NTERA-2, на пациенти с инсулти, което според авторите е довело до подобрение в клиничния ход на заболяването. В същото време не са наблюдавани случаи на злокачествено заболяване на трансплантирани клетки от терато-(ембрио)-карциномната линия NTERA-2 при пациенти с инсулт.

Първите линии от недиференцирани плурипотентни миши ембрионални стволови клетки са получени в началото на 80-те години на миналия век от Еванс и Мартин, които ги изолират от вътрешната клетъчна маса на бластоцистата - ембриобласта. Изолираните ESC линии запазват плурипотентност и способността да се диференцират в различни клетъчни типове под влияние на фактори в специална хранителна среда за дълго време.

Самият термин „ембрионални плурипотентни стволови клетки“ принадлежи на Лерой Стивънс, който, докато изучава ефекта на тютюневия катран върху честотата на развитие на тумори, обръща внимание на спонтанната поява на тестикуларен тератокарцином при линейни (129/v) мишки от контролната група. Клетките на тестикуларните тератокарциноми се характеризират с висока скорост на пролиферация и при наличие на течност от коремната кухина те спонтанно се диференцират с образуването на неврони, кератиноцити, хондроцити, кардиомиоцити, както и космени и костни фрагменти, но без никакви признаци на подредена цитоархитектура на съответната тъкан. Когато се поставят в култура, тератокарциномните клетки растат като плурипотентни клонове, неприкрепени към субстрата, и образуват ембриоидни тела, след което спират да се делят и претърпяват спонтанна нарушена диференциация в неврони, глия, мускулни клетки и кардиомиоцити. Стивънс установява, че тератокарциномът 129/v при мишки съдържа по-малко от 1% клетки, способни да се диференцират в различни специализирани соматични линии, а самата диференциация зависи от факторите, които ги влияят (съставът на перитонеалната течност, продукти от зрели клетки или тъкани, добавени към културата). Хипотезата на Лерой Стивънсън за наличието на ембрионални прогениторни клетки от зародишната линия сред тератокарциномните клетки е потвърдена: суспензия от ембриобластни клетки от преимплантационни ембриони в тъканите на възрастни мишки образува тератокарциноми, а чисти клетъчни линии, изолирани от тях след интраперитонеално приложение на реципиентни животни, се диференцират в неврони, кардиомиоцити и други соматични клетки, получени от всичките три зародишни слоя. В in vivo експерименти, трансплантацията на ембрионални стволови клетки (получени от ембриобласта, но не и от трофобласта) в миши ембриони от друга линия на бластомерни стадии 8-32 води до раждането на химерни животни (без развитие на тумори), в чиито органи са открити кълнове от донорска тъкан. Химеризъм е наблюдаван дори в зародишната клетъчна линия.

Първичните прогениторни зародишни клетки, изолирани от гениталния рудимент на миши ембрион, съответстват по морфология, имунологичен фенотип и функционални характеристики на ембрионалните стволови клетки (ESC), получени от Стивънсън от тератокарцином и ембриобласт. При химери, родени след въвеждане на ESC в бластоциста, алофеновата морфогенеза на органите се характеризира с мозаично редуване на донорски и реципиентни структурни и функционални единици на черния дроб, белите дробове и бъбреците. В някои случаи се наблюдава образуването на чревни крипти или чернодробни лобули, състоящи се както от реципиентни, така и от донорски клетки. Морфогенезата обаче винаги се осъществява според генетичната програма на вида, към който принадлежи реципиентът, а химеризмът е ограничен изключително до клетъчно ниво.

След това е установено, че пролиферацията на ембрионални стволови клетки (ESC) без цитодиференциация върху захранващ слой от клетки, получени от мезенхим (фетални фибробласти), протича със задължителното присъствие на LIF в селективни хранителни среди, които селективно осигуряват оцеляването само на стволови и прогениторни клетки, докато по-голямата част от специализираните клетъчни елементи умират. Използвайки такива методи, през 1998 г. Джеймс Томсън изолира пет иммортализирани линии ембрионални стволови клетки от вътрешната клетъчна маса на човешка бластоциста. През същата година Джон Герхарт разработва метод за изолиране на безсмъртни ESC линии от гениталния туберкул на четири- до петседмични човешки ембриони. Поради уникалните си свойства, само две години по-късно, ембрионалните стволови клетки и стволовите клетки на дефинитивните тъкани започват да се използват в практиката на регенеративната медицина и генната терапия.